李毛加，張金魁，李海麗，南措吉，扎西吉，才讓南加*

(1.青海民族大學 藥學院，青海 西寧 810007；2.青海省青藏高原植物資源化學重點實驗室，青海 西寧 810007)

0 引言

隨著生活節(jié)奏的加快，人們的生活、工作壓力日益增大，導致抑郁、失眠等眾多問題.我國成年人群中約有38.2%的人存在失眠癥狀，約50%的人有過失眠現(xiàn)象[1].大量的失眠癥患者伴有不同程度的抑郁、焦慮癥狀，增加糖尿病、冠心病、老年癡呆癥等的患病風險.三味豆蔻湯散是藏醫(yī)治療失眠的首選藥方，該方最早記載于《四部醫(yī)典》，由白豆蔻、蓽茇和孜然配伍而成，至今有1 300多年的應用歷史.索南卓瑪[2]等對其進行了初步的臨床觀察研究，但是尚未見相關藥效學研究報道.本文通過三味豆蔻湯散對小鼠自發(fā)活動次數(shù)影響實驗、閾下劑量戊巴比妥鈉誘導睡眠實驗和閾上劑量戊巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗，探討三味豆蔻湯散鎮(zhèn)靜催眠作用，旨在為三味豆蔻湯散的藥效評價提供實驗數(shù)據(jù)支撐.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

昆明種小鼠40只，SPF級，體重18～22 g，雌雄各半，合格證號2018003號，購于青海省實驗動物中心.飼養(yǎng)于青海民族大學藥學院動物房，環(huán)境溫度：室溫(24±2)℃，相對濕度55%～65%，分籠飼養(yǎng)，正常采光.動物飲用純凈水，飼料為實驗鼠維持顆粒料(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)，適應環(huán)境飼養(yǎng)一周，自由攝食與飲水，實驗前禁食不禁水12 h.

1.1.2 藥品和試劑

三味豆蔻湯散(藥物購自青海省藏醫(yī)院，青藥制字Z20122220)，地西泮注射液(規(guī)格10 mg/2 mL，哈藥集團三精制藥有限公司，批號：1801062)，戊巴比妥鈉(上?；瘜W試劑采購供應站，批號：1810251).

1.1.3 儀器

ZZ-6小鼠自主活動儀(成都泰盟科技有限公司)，AL204分析天平(梅特勒-托力多儀器上海有限公司)，F(xiàn)A1604電子天平(上海精密科學儀器有限公司)，JPT-5架盤天平(北京大柵欄天平廠)，SXHW型電熱套(河南太康教材儀器廠)，小鼠灌胃器(北京合力科創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)，一次性使用無菌注射器(規(guī)格1mL，山東新華安得醫(yī)療用品有限公司，批號：20181023).

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品溶液及試劑的制備

1.2.1.1 三味豆蔻湯散水煎煮藥液的制備

依據(jù)三味豆蔻湯散臨床使用劑量(3 g/人/天，人體重量標準為60 kg)設置了三個劑量組，低劑量組(400 mg/kg)、中劑量組(600 mg/kg)、高劑量組：(700 mg/kg).

稱取三味豆蔻湯散0.8、1.2、1.4 g，分別溶于50 mL水中，文火煎煮10 min，配制成低劑量、中劑量、高劑量三組的三味豆蔻湯散水煎煮液.

1.2.1.2 戊巴比妥鈉溶液的制備

分別稱取戊巴比妥鈉40、55 mg 溶于10 mL滅菌注射用水中，配制得40、55 mg/kg的戊巴比妥鈉溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用).

1.2.1.3 地西泮溶液的制備

取地西泮溶液2 mL，加入20 mL滅菌注射用水中稀釋，配制得2.0 mg/kg的地西泮溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用).

1.2.2 分組與給藥

取50只小鼠隨機分成五組，分別為陽性對照組、空白對照組、三味豆蔻湯散低劑量組、三味豆蔻湯散中劑量組、三味豆蔻湯散高劑量組.每組10只，雌雄各半，各藥物組小鼠分別按0.2 mL/10 g的給藥標準進行灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥7 d，空白對照組小鼠灌胃等容量生理鹽水.

1.2.3 三味豆蔻湯散對小鼠自發(fā)活動次數(shù)影響實驗

測試前將ZZ-6自主活動儀預熱30 min.各實驗組動物和空白對照組按照相應劑量進行灌胃，陽性對照組在1～6 d期間內灌胃等體生理鹽水，第7 d一次性灌胃給予2.0 mg/kg的地西泮溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，藥溶容積為0.2 mL/10 g[3-6].末次給藥30 min后將各組小鼠放入ZZ-6自主活動儀內，待小鼠適應5 min后[7]，開始記錄小鼠 30、60、90、120 min內活動次數(shù).

1.2.4 閾下劑量戊巴比妥鈉誘導睡眠實驗

1.2.4.1 戊巴比妥鈉閾下劑量的確定

戊巴比妥鈉閾下劑量為使90%～100%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥鈉的最大劑量，經預實驗確定小鼠戊巴比妥鈉閾下睡眠劑量為40 mg/kg.

1.2.4.2 閾下劑量戊巴比妥鈉致小鼠入睡率的影響

實驗按1.2.2項下正常灌胃7 d，5個處理組于第7 d給予三味豆蔻湯散30 min后腹腔注射閾下劑量戊巴比妥鈉40 mg/kg(臨用前現(xiàn)配)，戊巴比妥鈉劑量根據(jù)小鼠體質量計算(0.1 mL/10 g小鼠體質量)，觀察并記錄給予閾下劑量戊巴比妥鈉后30 min內各組小鼠入睡的只數(shù)(以30 min內翻正反射消失達1 min以上者為入睡)，計算各組小鼠睡眠發(fā)生百分率(入睡率)[8，9].

入睡率(%)=入睡動物數(shù)/動物總數(shù)×100%

1.2.5 閾上劑量戊巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗

1.2.5.1 戊巴比妥鈉閾上劑量的確定

戊巴比妥鈉閾上劑量為使小鼠100%入睡，但又不使睡眠時間過長的劑量，經預實驗確定小鼠戊巴比妥鈉閾上睡眠劑量55 mg/kg.

1.2.5.2 閾上劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間的影響

實驗方法同1.2.4.2項，5個處理組于第7 d給藥30 min后腹腔注射閾上劑量戊巴比妥鈉55 mg/kg(臨用前現(xiàn)配)，戊巴比妥鈉劑量根據(jù)小鼠體質量計算(0.1 mL/10 g小鼠體質量).以小鼠翻正反射消失為指標，記錄小鼠睡眠潛伏期(從給藥到小鼠翻正反射消失的時間)與睡眠持續(xù)時間(小鼠翻正反射消失至恢復所需的時間)[10-12].

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件，計量資料采用均數(shù)標準差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗.P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 三味豆蔻湯散對小鼠自發(fā)活動次數(shù)影響實驗

為確定三味豆蔻湯散的顯效時間，在進行實驗前以中劑量(即人臨床用藥等效劑量)進行了小鼠預實驗.發(fā)現(xiàn)三味豆蔻湯散的顯效時間大概是用藥后的60～90 min內，所以實驗以小鼠的60～90 min內的活動次數(shù)為依據(jù).

表1 三味豆蔻湯散不同劑量對小鼠自主活動的影響(x±s，n=10)

注：與空白對照組相比，*P<0.05；**P<0.01.

如表1所示，與空白對照組相比，三味豆蔻湯散中、高劑量組小鼠的活動次數(shù)和站立次數(shù)均明顯下降，說明該藥物對小鼠的自主活動次數(shù)有明顯抑制作用，其鎮(zhèn)靜效果明顯.高劑量組與中劑量組相比，高劑量組的小鼠的活動次數(shù)和站立次數(shù)未出現(xiàn)顯著下降，兩組無顯著性差異(P>0.05).

2.2 閾下劑量戊巴比妥鈉致小鼠入睡率的影響

如表2所示，與空白對照組相比，陽性對照組小鼠入睡率明顯增加(P<0.01)；三味豆蔻湯散水提物三個劑量組均能不同程度增加戊巴比妥鈉閾下劑量小鼠入睡只數(shù)，其中三味豆蔻湯散中、高劑量組效果較好.

表2 閾下劑量戊巴比妥鈉致小鼠入睡率的影響(x±s，n=10)

注：與空白對照組(生理鹽水)相比，*P<0.05；**P<0.01

2.3 閾上劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠潛伏期實驗

如表3所示，與空白對照組相比，三味豆蔻湯散中、高劑量組小鼠睡眠潛伏期均明顯縮短，睡眠時間明顯延長，說明三味豆蔻湯散水提物與戊巴比妥鈉有協(xié)同作用.高劑量組與中劑量組之間小鼠睡眠時間沒有顯著性差異.

表3 閾上劑量戊巴比妥鈉對小鼠睡眠時間的影響(x±s，n=10)

注：與空白對照組相比*P<0.05，**P<0.01

3 討論

隨著生活節(jié)奏的加快，失眠問題困擾著越來越多的人，現(xiàn)代醫(yī)學治療失眠的常見藥物主要包含苯二氮卓類、非苯二氮卓類、具有鎮(zhèn)靜作用的抗抑郁藥等幾種類型，長時間服用易產生依賴性、耐受性、戒斷癥狀、反跳作用等各種不良反應.故從傳統(tǒng)醫(yī)學經典復方和中草藥中發(fā)現(xiàn)具有治療失眠功效的藥物，對提高人們健康水平顯得非常重要.藏醫(yī)學認為，原發(fā)性失眠是由于“三因”中“隆”的偏升而引起，而“隆” 具有“寒”、“輕”、“動”等屬性，故通過甘味藥和辛味藥等具有“熱”、“膩”等效能的藥物相互配伍來抑制“隆”的“寒”、“輕”、“動”屬性.三味豆蔻湯散是以此理論配伍的經典復方，《四部醫(yī)典》曰：“豆蔻、孜然芹、蓽拔三味藥研細，用牛奶煎煮成湯，可治療失眠、不寐”[13].組成三味豆蔻湯散的白豆蔻味辛、苦，蓽茇味辛、甘，孜然味甘、辛，依據(jù)藏醫(yī)理論，甘味藥具有“重”、“膩”、“鈍”等藥性，辛味藥具有“熱”、“銳”等藥性，因此三味豆蔻湯散主要以其“熱”、“膩”、“重”等藥性來抑制 “隆”的“輕”、“寒”等特性來治療失眠癥，這體現(xiàn)了藏醫(yī)治療失眠是以平和“三因”為主的理念.

通過對藏藥三味豆蔻湯散鎮(zhèn)靜催眠藥效的研究，藏藥三味豆蔻湯散可降低小鼠自發(fā)活動的次數(shù)、增加閾下劑量戊巴比妥鈉致小鼠入睡率，延長閾上劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間，實驗結果顯示三味豆蔻湯散具有明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用.中、高劑量組組間無顯著差異，中劑量的給藥量與臨床常用劑量和《四部醫(yī)典藏藥配方大全》[14]中記載的三味豆蔻湯散的服用劑量大致相同，反映出臨床用藥劑量的合理性.組成三味豆蔻湯散的三種藥中含有桉油精、枯茗醛等揮發(fā)油類和胡椒堿、蓽茇明寧堿等生物堿類有效成分，據(jù)文獻報道三味豆蔻湯散中的揮發(fā)油及生物堿等都具有抗失眠、抗驚厥等作用[15-18]，充分佐證了藏藥三味豆蔻湯散的臨床用藥合理性，但是三味豆蔻湯散鎮(zhèn)靜催眠的作用機制有待于進一步深入研究.