劉 晨 馮 雪 邵冬華 何美琳 梁國威

嬰幼兒急性腹瀉病是我國兒童的常見病之一[1]。而輪狀病毒(rotavirus, RV)、諾如病毒(norovirus, NORV)、腸道腺病毒(enteric adenoviruses, EADV)和人星狀病毒(human astrovirus, HASTV)等是引起嬰幼兒急性腹瀉的主要病原體[2～5]。病毒性腹瀉感染力強、傳播較快、潛伏期短，極易造成疾病的流行。社會經(jīng)濟水平的提高、水質(zhì)和衛(wèi)生條件的改善并不能降低其發(fā)生率，需要醫(yī)務人員盡早對疾病做出診斷[6]。而相關腹瀉病毒的流行特征對于臨床防治嬰幼兒急性腹瀉具有重要的指導意義。

基于上述研究背景和目前的研究現(xiàn)狀，筆者對北京市航天中心醫(yī)院及周邊社區(qū)5歲以下兒童糞便中4種主要的腹瀉病毒RV、NORV、EADV和HASTV感染和混合病毒感染進行為期1年全面的調(diào)查統(tǒng)計，使用熒光免疫法對上述4種腹瀉病毒進行檢測，分析其流行病學情況；同時用PCR法檢測EADV進行方法學比對試驗，為制定5歲以下兒童病毒性腹瀉的預防控制策略提供科學依據(jù)。

對象與方法

1.研究對象:選取航天中心醫(yī)院和永定路社區(qū)衛(wèi)生服務中心2017年1～12月連續(xù)1年在門診因急性腹瀉就診的5歲以下兒童。急性腹瀉定義標準：①大便性狀較平時改變，呈水樣或蛋花樣，無黏液和膿血，次數(shù)較平時增多，或24h內(nèi)稀便≥3次，伴或不伴嘔吐和發(fā)熱；②病程不超過14天。門診患兒入選需符合以下標準：①因為急性腹瀉就診；②大便鏡檢：WBC<5/HPF，并且無巨噬細胞。收集上述研究對象糞便標本、人口學資料及流行病學資料。本研究中受試者監(jiān)護人簽署知情同意書，本研究得到航天中心醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準同意(批件文號：20150311-YNKS-05)。

2.標本采集及處理：取患兒新鮮糞便樣本約3～5g或水樣便3～5ml，分為兩份。一份置于PBS混懸液中混勻3000r/min離心10min，上清液作為標本直接用熒光免疫法進行檢測；另一份于-80℃冷凍保存，用于DNA的提取。DNA提取方法是將0.1g或0.1ml糞便樣本置于1ml 0.9%NaCl注射液中，混勻制成10%的糞便懸液，8000r/min離心5min，吸取上清液提取糞便中的DNA。采用病毒核酸提取試劑盒(中國臺灣地區(qū)Geneaid公司)提取DNA，操作步驟嚴格按照說明書進行。

3.檢測方法:腹瀉病毒4項(RV、NORV、EADV和HASTV)抗原檢測采用熒光免疫法，由北京博暉創(chuàng)新光電技術股份有限公司提供的聯(lián)合檢測試劑盒(試劑批號:20170101)及其配套檢測儀器(BH400-Ⅱ熒光免疫層析分析儀)。針對EADV病毒hexon基因片段，采用的特異性上游引物為5′-TTCCCCATGGCICAYAACAC-3′；下游引物為5′-CCCTGGTAKCCRATRTTGTA-3′[7]。擴增片段長度482bp，PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)有無擴增產(chǎn)物條帶進行鑒定，詳見圖1。

圖1 EADV病毒hexon基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖M.DL2000 DNA Marker；1，2.EADV病毒hexon基因PCR產(chǎn)物

4.統(tǒng)計學方法：使用SPSS 14.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間率的比較采用χ2檢驗；EADV抗原熒光免疫法與PCR法檢出率比較采用配對χ2檢驗，并以Kappa值作為兩種檢測方法一致性好壞的評價標準(Kappa≥0.75 一致性佳，0.40

結 果

1.4種病毒抗原熒光免疫法檢出情況:1398例腹瀉患兒糞便標本中共檢出陽性699例(50.00%)，其中661例(47.28%)為單病毒感染，38例(2.72%)為混合病毒感染，詳見圖2。在單病毒感染中，RV、NORV、EADV和HASTV的陽性病例依次為422例(30.19%)、138例(9.87%)、60例(4.29%)和41例(2.93%)；在混合病毒感染中，最為常見的是RV和NORV同時感染為24例，其次是RV和EADV同時感染11例，而RV、NORV和EADV 3種病毒同時感染檢測出3例。

圖2 4種病毒抗原熒光免疫法檢出情況

在1398例標本中，單病毒感染和混合感染合計的RV、NORV、EADV和HASTV的陽性分別為460例(32.90%)、165例(11.80%)、74例(5.29%)和41例(2.93%)，4種病毒的陽性構成比依次為62.16%、22.30%、10.00%和5.54%。

2.每月總例數(shù)及總陽性率檢出情況：檢測總例數(shù)及總陽性率檢出情況按照自然月分布顯示詳見圖3，1月送檢總例數(shù)最多為148例，12月份病毒性腹瀉患病例數(shù)最多為120例，12月份檢出陽性率最高為84.50%。8月份送檢總例數(shù)和病毒性腹瀉患病例數(shù)均為最少，分別為84例和23例，陽性率也最低為27.38%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)?？傊?，秋、冬季節(jié)送檢總例數(shù)、病毒性腹瀉患病例數(shù)及陽性率均高于春、夏季節(jié)。

圖3 每月總例數(shù)及總陽性率檢出情況

3.不同性別、年齡患兒4種病毒抗原檢出情況：1398例腹瀉患兒糞便標本中，男性729例，女性669例，其中，4種單病毒感染和混合病毒感染的男性、女性患兒例數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。月齡分組顯示，RV、NORV、HASTV和混合病毒感染在7～12、13～24和25～36月齡組患兒中陽性率均比其他月齡組高，EADV在7～12月齡組的陽性率比其他月齡組高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，詳見表1。

4.不同時間患兒4種病毒抗原檢出情況:4種單病毒感染和混合病毒感染情況按照自然月分布進行分析顯示(圖4)，RV在1～2月份和10～12月份，也就是秋、冬季節(jié)陽性率最高，與3～9月份比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；NORV陽性率在4～5月份和12月份出現(xiàn)雙峰升高，與1～3月份和6～11月份比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；EADV在5～8月份，也就是夏季陽性率最高，與1～4月份和9～12月份比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；HASTV陽性率在9～11月份明顯升高，與1～8月份和12月份比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而對于混合病毒感染，各季節(jié)感染率比較，差異無統(tǒng)計學意義。

表1 不同性別、年齡患兒腹瀉病毒陽性檢出情況[n(%)]

圖4 不同時間患兒4種病毒抗原檢出情況

5.EADV抗原熒光免疫法與PCR法檢出率比較：采用配對資料的χ2檢驗對熒光免疫法和PCR法的檢測結果進行對比分析，熒光免疫法抗原檢出74例，PCR法檢出88例。PCR法檢出率占總檢出率的88.89%(88/99)，熒光免疫法檢出率占總檢出率的74.75%(74/99)，兩種方法檢出共同陽性63例，一致陽性率為63.60%(63/99)。配對χ2檢驗顯示，PCR法檢出率高于熒光免疫法抗原檢出率，陽性檢出率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=823.397，P=0.029)，但Kappa=0.764，顯示兩種方法仍具有一致性，詳見表2。

表2 熒光免疫法與PCR法對腸道腺病毒的檢出情況(n)

討 論

病毒性腹瀉屬于《中華人民共和國傳染病防治法》中規(guī)定的丙類傳染病，對各年齡人群特別是5歲以下兒童的身體健康有極大威脅，這其中主要包括了RV、NORV、EADV和HASTV等多種腹瀉病毒。本研究對航天中心醫(yī)院及周邊社區(qū)5歲以下兒童門診病例中常見的4種腹瀉病毒及混合病毒感染情況進行了調(diào)查統(tǒng)計，檢出腹瀉病毒的標本陽性率為50.00%，這與近年來報道的兒童腹瀉病毒陽性率為24.05%～58.42%相符，而且檢測方法不同、研究地區(qū)不同也會造成結果的差別[8～10]。其中RV(30.19%)是導致腹瀉最主要的病毒，NORV(9.87%)、EADV(4.29%)和HASTV(2.93%)感染陽性率相對較低，此外還有38例為混合病毒感染。

RV在世界范圍內(nèi)是引起嬰幼兒急性和重癥腹瀉最常見的病原體。最近監(jiān)測顯示我國因腹瀉入院檢查的5歲以下兒童中RV陽性率高達68.60%，也是目前相關研究最深入的腹瀉病毒和唯一有疫苗能夠預防的腹瀉病毒[11]。NORV屬單股正鏈RNA病毒，是第一個被證實可引起人類急性胃腸炎的病毒，極易發(fā)生抗原變異，被稱為“胃腸道流感病毒”。已有研究證實NORV與12%的輕、中度腹瀉患者有關，是嬰幼兒腹瀉僅次于RV的病毒性致病原[12]。EADV是一種雙鏈DNA病毒，感染呈全球性分布，在嬰幼兒急性腹瀉中EADV的檢出率為1.1%～12.0%，但值得注意的是，在無癥狀兒童的糞便標本中也可以檢測出EADV，也就是說EADV可能會引起隱性感染[7,13]。HASTV屬于單股正鏈RNA病毒，世界各地均有報道感染，己經(jīng)確認可感染各個年齡段人群，但主要感染兒童、老年人和免疫缺陷人群。世界各地的感染發(fā)生率報道有所差別，其中北京兒童醫(yī)院調(diào)查得出的結論是9.0%[14]。

秋、冬季節(jié)送檢總例數(shù)、病毒性腹瀉患病例數(shù)及陽性率均高于春、夏季節(jié)。4種單病毒感染及混合病毒感染均無性別差異，但是在7～36月齡為病毒性腹瀉的高發(fā)月齡。這可能與兒童的生理免疫狀態(tài)特點有關，6個月及以下嬰幼兒從母體乳汁中獲得了大量的抗體，尤其是sIgA抗體，有很強的免疫保護作用；而6個月以上兒童由于母乳喂養(yǎng)的結束、母乳中抗體量顯著減少且自身的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟、消化系統(tǒng)功能薄弱，因此容易感染各種病原體[15]。3歲以上兒童隨著自身免疫功能的逐漸完善，血清及小腸分泌特異性免疫球蛋白的增加，抗感染能力增強。由于樣本量有限、調(diào)查年限較短，統(tǒng)計結果可能有一定的誤差，但對總體趨勢無明顯影響。在時間分布特征上，4種單病毒感染及混合病毒感染也表現(xiàn)出了明顯的差別，RV秋、冬季節(jié)比春季高發(fā)，NORV春季和秋、冬季節(jié)高發(fā)，EADV在夏季高發(fā)，HASTV的陽性率在秋季明顯升高。而對于混合病毒感染的樣本，由于例數(shù)較少，其差異無統(tǒng)計學意義。

除此以外，筆者還對熒光免疫法和PCR法的檢測結果進行比較分析，PCR法檢出率高于熒光免疫法抗原檢出率，兩種方法的陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。采用Kappa值作為兩種檢測方法一致性好壞的評價標準，為0.764≥0.750一致性佳。其中PCR法對EADV的陽性檢出率更高。造成陽性檢出率差異的原因可能為：(1)腺病毒是雙鏈DNA病毒，含52種血清型，根據(jù)其生物學特點將其分為A～F 6個亞類[4]。其中EADV 就是指F亞類中的F40、F41，是引起兒童急性胃腸炎的主要血清型。而PCR法中針對腺病毒hexon基因片段的引物是針對所有亞型腺病毒的，包括但不僅限于EADV，在以后的研究中，筆者還會對腺病毒的基因分型進行進一步分析。(2)在無癥狀兒童的糞便標本中也可以檢測到EADV，表明EADV有引起隱性感染的可能性。(3)熒光免疫法敏感度較高，也就是說假陽性率可能會偏高[16]。經(jīng)過方法學的比較，不難看出快速的篩查方法對輔助診斷病毒性腹瀉很重要。目前腹瀉病毒的檢測多采用PCR檢測，操作步驟多、耗時長，多重病毒聯(lián)合PCR檢測由于假陽性率較高應用并不廣泛，且篩查相對費時、費力[17]。而熒光免疫法實驗過程相對簡單、耗時短，且一次實驗能同時檢測4種病毒，更好地適應了臨床需求，但假陽性率高，更適合初篩，進一步確認還是需要做PCR檢測[16]。而兩種檢測方法聯(lián)合檢測，能大大提高腸道腺病毒的陽性檢出率，減少漏診率。

綜上所述，通過本項研究筆者對航天中心醫(yī)院及周邊社區(qū)5歲以下兒童的病毒性腹瀉病原譜有了基本了解，4種腹瀉病毒在陽性檢出率、年齡分布、時間分布上均有一定的特征，這為病毒性腹瀉的預防控制、疾病監(jiān)測方面提供了基礎數(shù)據(jù)，但本研究對各病毒基因型的構成情況未深入研究。為提高檢出率、減少漏診率、滿足臨床日益增長的檢測需求，檢測相關腹瀉病毒時，建議采用抗原陽性檢出率較高、檢測工效較高的實驗方法比如熒光免疫法作為初步篩查，同時在必要情況下結合PCR法以防止漏檢，為臨床治療提供及時、有效的實驗信息。