熱孜萬古麗·烏斯曼 沙依拉·海米提 郭艷英

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，在世界范圍內(nèi)較為常見，且近年來發(fā)生率越來越高，嚴重威脅著人類的健康和生活質(zhì)量[1～3]。糖尿病主要發(fā)病機制有糖脂代謝異常、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等[4]。葡萄糖代謝紊亂是糖尿病癥狀中最突出的表現(xiàn)，從胰島中產(chǎn)生和分泌的胰島素對于維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)起著十分關(guān)鍵的作用[5]。胰島由多個內(nèi)分泌細胞組成，主要包括α、β、δ和PP細胞，胰島內(nèi)分泌細胞中胰島β細胞占60%～80%，其能夠分泌并釋放胰島素[6]。胰島素是一種合成代謝激素，可增加細胞對血糖的吸收，從而降低血糖水平，而胰島素抵抗和胰島β細胞功能障礙是2型糖尿病的兩個主要病理與生理學特征[7]。

微小 RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為18～24 個核苷酸的非編碼低分子單鏈RNA，主要通過與靶基因mRNA 3′UTR 端結(jié)合來發(fā)揮作用，可以通過翻譯抑制或降解其靶mRNA來調(diào)控相關(guān)基因的表達[8,9]。大量研究表明，miRNA廣泛存在于組織和器官中，并且在多種疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中起到調(diào)控作用[10]。已發(fā)現(xiàn)許多轉(zhuǎn)錄因子和miRNA可調(diào)節(jié)胰島功能，miRNA在調(diào)控胰島素的分泌和抵抗、葡萄糖水平等方面均發(fā)揮重要作用[11～13]。本研究通過抑制或過表達MIN6細胞中miR-31-5p來檢測其對細胞增殖以及胰島素分泌的影響，并建立2 型糖尿病小鼠模型，通過給予尾靜脈注射miR-31-5p inhibitor NC和miR-31-5p inhibitor來觀察小鼠胰腺組織變化，探討miR-31-5p在2 型糖尿病小鼠胰島素抵抗中的作用。

材料與方法

1.主要與材料：主要試劑與材料：MIN6小鼠胰島細胞株購自上海博谷生物科技有限公司，小鼠胰島素ELISA檢測試劑盒購自美國ALPCO公司，LipofectamineTM2000、CCK-8試劑盒、HE染色試劑盒購自上海碧云天生物公司，鏈脲佐菌素和TRIzol試劑購自美國Simga公司，All-in-OneTMcDNA第一鏈合成試劑盒、All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR試劑盒購自美國GeneCopoeia公司，基礎(chǔ)飼料與高脂高糖飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，兔抗胰島素、兔抗Cleaved Caspase-3與HRP標記的羊抗兔IgG抗體購自英國Abcam公司。80～90日齡的SPF級C57BL/6J小鼠由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證號: SCXK(新)2018-0002。

2.細胞培養(yǎng)：將MIN6小鼠胰島細胞株置于含10%胎牛血清、100μg/ml慶大霉素、100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，放在37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，待細胞覆蓋率達80%～90%時，棄去培養(yǎng)基，用無菌的PBS清洗，加入0.25%胰蛋白酶消化細胞5min，進行傳代培養(yǎng)。

3.細胞轉(zhuǎn)染：將MIN6細胞按照每孔 2×105個接種至 6 孔細胞板上，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育過夜。實驗分為Blank組(空白對照組)、miR-31-5p mimic 組(轉(zhuǎn)染 miR-31-5p mimic)、miR-31-5p mimic NC 組(轉(zhuǎn)染miR-31-5p mimic陰性對照)、miR-31-5p inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-31-5p inhibitor)、miR-31-5p inhibitor NC組(轉(zhuǎn)染miR-31-5p inhibitor陰性對照)。miR-31-5p mimic、miR-31-5p inhibitor及miR-31-5p mimic/ inhibitor NC片段均由廣州銳博生物公司設(shè)計并合成。Blank組正常培養(yǎng)不進行轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 說明書操作，將Lipofectamine 2000分別與50nmol/L miR-31-5p mimic、100nmol/L miR-31-5p inhibitor和50nmol/L miR-31-5p mimic/inhibitor NC轉(zhuǎn)染至MIN6細胞中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染4h后，更換新鮮RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

4.qRT-PCR：使用TRIzol試劑提取轉(zhuǎn)染后各組MIN6細胞，采用核酸蛋白檢測儀Nanodrop測定提取的RNA純度和濃度。以All-in-OneTMcDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR試劑盒進行擴增，以U6作為內(nèi)參基因，擴增體系為：All-in-One qPCR Mix 10μl, cDNA 2μl, All-in-One miRNA qPCR Primer 2μl, Universal Adaptor PCR Primer 2μl, 50×ROX Reference Dye 0.5μl, 無酶水3.5μl。擴增條件為： 95℃預變性10min，95℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 10s，共40個循環(huán)。使用的引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，具體引物序列如下：miR-31-5p上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGAGGCAAGA-3′，下游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′； U6 上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

5.CCK-8：將成功轉(zhuǎn)染的各組MIN6細胞1×105個/孔接種至96孔板，分別在37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 0、12、24、36、48、60、72h 后取出細胞，每孔加入10μl CCK-8溶液，孵育2h，按照 CCK-8 試劑盒說明進行操作，在酶標儀上450nm處檢測各孔細胞吸光度(A)值，繪制細胞的生長曲線圖。

6.酶聯(lián)免疫吸附測定：將MIN6細胞以 5×104個/孔接種于24孔板內(nèi)并進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h棄去原有培養(yǎng)基，每孔加500μl無糖KRBH溶液，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h。棄無糖 KRBH 溶液，換用含5mmol/L 葡萄糖的KRBH 溶液孵育1h后，4℃離心20min收集上清液，或換用20mmol/L 葡萄糖的KRBH溶液孵育1h離心收集上清液。將所收集的上清液放置于-80℃，按照胰島素ELISA試劑盒檢測胰島素的濃度，采用酶標儀測定各孔在450nm波長處的吸光值。

7.動物造模：將60只C57BL/6J小鼠隨機分為正常對照組(10只)、造模組(50只)，并分別給予基礎(chǔ)飼料和高脂高糖飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周后，隔夜禁食12h，造模組小鼠空腹腹腔注射鏈脲佐菌素 30mg/kg，正常對照組小鼠空腹腹腔注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，每天1次，連續(xù)3次。在末次注射3天后剪尾取血，采用全自動生化分析儀測定小鼠空腹血糖值(FBG)，若FBG>11.1mmol/L且連續(xù)出現(xiàn)飲水量和尿量增多等現(xiàn)象則視為建模成功。選取造模成功的小鼠40只隨機分為NC組和miR-31-5p inhibitor組，每組 20只，NC組尾靜脈注射miR-31-5p inhibitor NC(50mg/kg)，miR-31-5p inhibitor組尾靜脈注射miR-31-5p inhibitor(50mg/kg)，每3天注射1次。正常組小鼠同時注射等量0.9%NaCl溶液，21天后測定各組小鼠FBG，并通過HE染色和免疫組化染色觀察胰腺組織的變化。

8.HE染色：以斷頭法處死各組小鼠，腹部解剖采集胰腺組織進行HE染色。PBS沖洗材料，在4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，切成厚度為3μm的薄片。蘇木精染色5min，流水沖洗后，伊紅染色液染色3min，脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察并拍照。于光學顯微鏡下觀察小鼠胰腺組織病理學形態(tài)。

9.免疫組織化學染色：將石蠟切片脫蠟至水，采用0.01mol/L枸椽酸鹽緩沖液進行抗原修復，3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶，然后分別加一抗兔抗胰島素(1∶3000)與兔抗cleaved caspase-3(1∶200)，4℃孵育過夜。次日使用 PBS 沖洗2次，每次3min，再加二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶5000)室溫孵育15min，PBS 沖洗2次，DAB 顯色。經(jīng)過復染、脫水、透明、封片，在電子顯微鏡下觀察，進行圖像采集與分析。

結(jié) 果

1.miR-31-5p對MIN6細胞增殖的影響：RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組MIN6細胞中miR-31-5p表達情況。與miR-31-5p mimic NC組比較，miR-31-5p mimic組miR-31-5p的表達量顯著增加(P<0.05)，而miR-31-5p inhibitor組的表達量較miR-31-5p inhibitor NC組顯著降低(P<0.05，圖1)。CCK-8檢測結(jié)果表明，與miR-31-5p mimic NC組比較，miR-31-5p mimic組MIN6細胞在轉(zhuǎn)染36h時細胞增殖能力顯著下降，在本研究的時間范圍內(nèi)，這種趨勢保持到轉(zhuǎn)染后96h(P<0.05)。與miR-31-5p inhibitor NC組比較， 在轉(zhuǎn)染后24h時miR-31-5p inhibitor 組MIN6細胞增殖能力顯著提高，36、72和96h時也均高于miR-31-5p inhibitor NC組(P<0.05，圖2)。

2.miR-31-5p對MIN6細胞胰島素分泌的影響：分別用5mmol/L葡萄糖的KRBH溶液或20mmol/L葡萄糖的KRBH溶液刺激轉(zhuǎn)染的各組MIN6細胞1h后，ELISA檢測分泌胰島素含量的實驗結(jié)果顯示，20mmol/L 葡萄糖的高糖刺激使胰島素分泌增加，而與miR-31-5p inhibitor NC組比較， 20mmol/L 葡萄糖的KRBH溶液刺激下，miR-31-5p mimic組MIN6細胞胰島素的分泌受到抑制(P<0.01)，而miR-31-5p inhibitor 組胰島素的分泌量較miR-31-5p mimic NC組增加(P<0.01)。而在基礎(chǔ)糖濃度即5mmol/L 葡萄糖刺激下轉(zhuǎn)染 miR-31-5p mimic 或 miR-31-5p inhibitor的MIN6細胞胰島素的分泌水平?jīng)]有受到影響(表1)。

圖1 RT-PCR檢測各組MIN6細胞miR-31-5p表達水平與miR-31-5p mimic NC組比較，*P<0.05；與miR-31-5p inhibitor NC組比較，#P<0.05

圖2 CCK-8檢測各組MIN6細胞增殖情況與miR-31-5p mimic NC組比較，*P<0.05；與miR-31-5p inhibitor NC組比較，#P<0.05

表1 ELISA檢測各組MIN6細胞分泌胰島素量

與miR-31-5p mimic NC組比較,*P<0.01;與miR-31-5p inhibitor NC組比較,#P<0.01

3.miR-31-5p對2 型糖尿病小鼠胰島素抵抗的影響：小鼠空腹腹腔注射鏈脲佐菌素實驗結(jié)束3天后檢測FBG，與正常對照組比較，模型組小鼠的FBG明顯升高(P<0.01)，達到15.87±3.34mmol/L，說明造模成功。進行尾靜脈注射miR-31-5p inhibitor NC與miR-31-5p inhibitor，21天后檢測FBG結(jié)果顯示，與miR-31-5p inhibitor NC組比較，miR-31-5p inhibitor 組FBG顯著下降(P<0.01，表2)。HE 染色結(jié)果詳見圖3，對照組(Blank)小鼠胰腺組織中胰島呈圓形或橢圓形，胰島內(nèi)細胞排列規(guī)則，細胞界限清晰且胞質(zhì)飽滿，染色均勻；miR-31-5p inhibitor NC組胰島發(fā)生萎縮，形態(tài)不規(guī)則，胰島細胞細胞核固縮，胞質(zhì)空泡增多，染色不均勻且部分細胞內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)沉積；miR-31-5p inhibitor組胰島病理現(xiàn)象較miR-31-5p inhibitor NC組明顯改善，胰島形態(tài)改變較小，胰島細胞細胞核固縮程度減小，胞質(zhì)空泡較少，染色較為均勻。免疫組織化學染色檢測了各組小鼠胰腺組織，片鏡下陽性反應(yīng)物呈棕黃色。對照組(Blank)小鼠胰腺中幾乎無裂解caspase-3的表達，miR-31-5p inhibitor NC組胰腺中裂解caspase-3表達明顯，而miR-31-5p inhibitor組裂解caspase-3的表達較miR-31-5p inhibitor NC組明顯下降。與HE染色結(jié)果一致，胰島素免疫組織化學分析表明對照組(Blank)小鼠胰島為圓形，胰島細胞(免疫反應(yīng)陽性細胞)主要分布于胰島中心部位，胞質(zhì)中充滿胰島素染色顆粒，均勻地散布于整個胰島且胞核不著色。miR-31-5p inhibitor NC組胰島形態(tài)被破壞，染色片中胰島素染色顆粒較少，細胞皺縮且排列分布不規(guī)則，有的胞質(zhì)中胰島素染色顆粒明顯減少呈空虛狀態(tài)。而miR-31-5p inhibitor組較miR-31-5p inhibitor NC組這些現(xiàn)象均有不同程度的改觀(圖4)。

表2 抑制miR-31-5p表達對2 型糖尿病小鼠FBG的影響

與正常對照組比較,*P<0.01；與miR-31-5p inhibitor NC組比較,#P<0.01

圖3 各組小鼠胰腺組織病理學形態(tài)(HE,×200)A.Blank;B.miR-31-5p inhibitor NC;C.miR-31-5p inhibitor

圖4 各組小鼠胰腺組織裂解caspase-3和胰島素的陽性表達(IHC,×100)

討 論

1型糖尿病的特征是胰島β細胞逐漸凋亡從而導致胰島素的缺乏[14]。另外，胰島β細胞功能障礙在2型糖尿病的進展過程中起著關(guān)鍵作用，研究表明2型糖尿病的患者體內(nèi)胰島β細胞數(shù)目減少[15]。因此，促進胰島β細胞的增殖與再生不僅是1型糖尿病的治療策略，也成為了2型糖尿病研究與治療的手段。

miRNA不僅在胰島β細胞增殖、凋亡、胰島素合成與釋放等過程中發(fā)揮作用，而且可以通過調(diào)控胰島素轉(zhuǎn)錄因子的表達進而維持機體糖平衡，例如miR 7、miR 26、miR 236、miR 357等已被證實參與胰腺發(fā)育、胰島素合成與分泌等過程[16,17]。此外，也有報道指出，胰島β細胞團與miRNA之間存在聯(lián)系，miRNA在胰島β細胞中具有細胞自主功能。例如，在懷孕或肥胖大鼠的胰島β細胞中miR-338-3p表達降低，特異性敲除胰島β細胞的miR-200可增加肥胖糖尿病小鼠β細胞的凋亡[18,19]。本研究通過將miR-31-5p mimic 與miR-31-5p inhibitor轉(zhuǎn)染到分化期的MIN6細胞中，以鑒定miR-31-5p是否影響MIN6細胞的增殖。研究結(jié)果表明，過表達miR-31-5p抑制MIN6細胞增殖而抑制miR-31-5p則促進MIN6細胞增殖。由胰島β細胞分泌和釋放的胰島素能夠?qū)Ⅲw內(nèi)血糖維持在一個正常的水平，當胰島β 細胞功能受損，胰島素分泌不足時會引發(fā)糖尿病[20,21]。因此，筆者探究了在20mmol/L 葡萄糖的高糖刺激下MIN6細胞的胰島素分泌水平，通過檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-31-5p mimic的MIN6細胞胰島素的分泌受到抑制，而轉(zhuǎn)染miR-31-5p inhibitor細胞的胰島素分泌量增加。由此說明，抑制MIN6細胞中miR-31-5p的表達有助于胰島β 細胞活性增加與胰島素分泌增加，從而起到降低血糖的作用。

2型糖尿病與肥胖密切相關(guān)。脂肪組織在葡萄糖代謝中起重要作用，能夠產(chǎn)生大量激素和細胞因子[22]。本研究通過高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素30mg/kg構(gòu)建2 型糖尿病小鼠模型，檢測到模型組小鼠的FBG達到15.87±3.34mmol/L，由此說明造模成功。接著對2型糖尿病小鼠進行尾靜脈注射miR-31-5p inhibitor NC與miR-31-5p inhibitor，21天后檢測發(fā)現(xiàn)miR-31-5p inhibitor 組FBG較miR-31-5p inhibitor NC組明顯下降。同時，通過胰腺組織形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)注射miR-31-5p inhibitor NC的小鼠胰腺組織發(fā)生病理損傷，裂解的caspase-3明顯表達，注射miR-31-5p inhibitor的胰腺組織病理損傷明顯改善，裂解的caspase-3幾乎沒有表達，提示抑制miR-31-5p可有效改善 2 型糖尿病大鼠胰島素抵抗并改善胰腺病理損傷。

綜上所述，本研究證明了抑制miR-31-5p 表達可以促進MIN6細胞的增殖，從而保護胰島的功能，有效改善糖尿病小鼠的空腹血糖。miR-31-5p可能成為治療2型糖尿病的重要的標靶，為有效治療2型糖尿病提供了新的方法。后續(xù)研究將會深入探討miR-31-5p的作用靶點以及具體機制，為糖尿病的預防及治療提供可行的新思路。