王紅麗 李志強(qiáng) 范 平 張格格 郭玉君

心房疾病是一個(gè)日益嚴(yán)重的全球性問題。心房顫動(dòng)(atrial fibrillation，AF)是最常見的心律失常之一，影響全球3300萬患者，在未來的30年預(yù)計(jì)其發(fā)生率將增加3倍[1]。目前藥物治療的效果不理想并且還有一定的不良反應(yīng)，包括藥物引起的心律失常和心臟毒性[2]。目前藥物的有效性是有局限的，可能是由人們對(duì)心律失常復(fù)雜的病理生理學(xué)認(rèn)識(shí)不完全所致[3]。隨著心臟電生理技術(shù)的發(fā)展尤其是膜片鉗技術(shù)在基礎(chǔ)領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，越來越多證據(jù)表明,心房顫動(dòng)的發(fā)生與離子通道的功能和結(jié)構(gòu)改變密切相關(guān)[4，5]。電生理檢測(cè)過程中由于完整心臟體積較大，導(dǎo)致電壓鉗實(shí)驗(yàn)中不能充分控制膜電位。這種限制是分離單個(gè)心肌細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的主要?jiǎng)恿?。闡明離子電流和細(xì)胞微結(jié)構(gòu)的病理變化需要分離的單個(gè)心房肌細(xì)胞。目前關(guān)于分離成年犬單個(gè)心房肌細(xì)胞的方法比較的報(bào)道較少[6，7]。急性分離的細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上都與活的生物體生理性特征相似，非常適合觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)分子精確定位的實(shí)驗(yàn)，也經(jīng)常用于細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞力學(xué)和蛋白質(zhì)生物化學(xué)的研究。心肌細(xì)胞急性分離技術(shù)方法至關(guān)重要，能夠保持心肌細(xì)胞在體內(nèi)的功能和完整性。

因此，為了獲得穩(wěn)定的心房肌細(xì)胞，本研究運(yùn)用兩種不同的方法分離犬心房肌細(xì)胞，并從心房肌細(xì)胞成活率、細(xì)胞自主收縮、酶的使用量、酶消化時(shí)間和記錄起搏電流(If)等方面進(jìn)行比較。筆者對(duì)整體心臟的結(jié)扎部位、灌流液成分、酶的選擇等方面進(jìn)行改進(jìn)，摸索出簡(jiǎn)單、快捷的犬心房肌細(xì)胞分離方法，為研究心房肌細(xì)胞生理和病理特性提供了實(shí)驗(yàn)材料。

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：普通級(jí)比格犬8條，雌雄不拘，體質(zhì)量12～14kg，2歲，均購于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 [SCXK(新)2016-0001)，課題實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)方案及具體實(shí)施步驟已經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)、審核，審批號(hào)為IACUC-20170210-03。實(shí)驗(yàn)實(shí)施推進(jìn)過程嚴(yán)格按照美國(guó)國(guó)立研究機(jī)構(gòu)設(shè)立的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和護(hù)理指南進(jìn)行。犬植入起搏器，持續(xù)左心耳起搏8周，構(gòu)建慢性心房顫動(dòng)模型。

2．主要試劑與儀器：Ⅱ型膠原酶(Worthington)，蛋白酶(Protease，美國(guó)Sigma公司)，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，美國(guó)Sigma公司)，多導(dǎo)電生理儀(LEAD-7000)，多功能監(jiān)護(hù)儀(BeneviewT5)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用的埋藏式起搏器(上海復(fù)旦大學(xué)電子生物工程有限公司)光學(xué)倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

3．實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：無鈣臺(tái)式液(NaCl 140mmol/L，KCl 5mmol/L，MgCl2·6H2O 1mmol/L，HEPES 10mmol/L，Glucose 10mmol/L)。含鈣臺(tái)式液(NaCl 140mmol/L，KCl 5mmol/L，MgCl2·6H2O 1mmol/L，HEPES 10mmol/L，Glucose 10mmol/L，CaCl21.8mmol/L)。高鉀臺(tái)式液(NaC1 140mmol/L，KC1 15mmol/L，MgCl2·6H2O 1mmol/L，HEPES 10mmol/L，Glucose 10mmol/L，CaCl21.8mmol/L)。KB液(細(xì)胞保存液K-Glutamate 120mmol/L，KCl 10mmol/L，KH2PO410mmol/L，MgSO41.8mmol/L，K-EGTA 0.5mmol/L，Taurine 10mmol/L，HEPES 10mmol/L，Glucose 20mmol/L，BSA 0.2%)，以上溶液用NaOH調(diào)pH值至7.3～7.4。酶液(改良方法)：取150ml無鈣液，加入濃度為0.5%的Ⅱ型膠原酶、0.01%Protease和0.1%BSA。酶液(傳統(tǒng)方法)：取250ml無鈣液加入Ⅱ型膠原酶(125U)和0.1%BSA。細(xì)胞外液(NaCl 140mmol/L，KCl 5mmol/L，CaCl21.8mmol/L，MgCl21mmol/L，BaCl21mmol/L， HEPES 10mmol/L，Glucose 10mmol/L；用NaOH調(diào)pH值至7.4)。細(xì)胞內(nèi)液(K+-ATP 5mmol/L，KCl 50mmol/L，MgCl21mmol/L，HEPES 10mmol/L，EGTA 2mmol/L；用KOH調(diào)pH值至7.2)。

4．心肌細(xì)胞分離方法：改良方法：成年雄性犬稱重后，用3%戊巴比妥鈉麻醉，靜脈給肝素(1000U/kg)，開胸取心臟，放入4℃氧飽和的高鉀液。在主動(dòng)脈冠狀動(dòng)脈竇口用高鉀液反復(fù)沖洗去除心腔及血管內(nèi)的殘血，隨后從左前旋支插入自制導(dǎo)管，剪去右心房和左右心室以及室間隔等其他組織，只保留左右心房和心耳(目的是分離心房肌)，手術(shù)線縫合固定。心臟懸掛于Langendorff灌流，給予30ml/min的含鈣液灌流。在各個(gè)滲水點(diǎn)用手術(shù)線結(jié)扎，直到肉眼看不見滲水點(diǎn)為止，此時(shí)可見左心耳，左心房充盈。無鈣臺(tái)式液繼續(xù)灌流，灌流量根據(jù)所保留的心臟組織大小而定。酶液充盈于整個(gè)心臟時(shí)，流出的酶液循環(huán)灌流約35～50min，剪取小部分組織在KB液中輕輕搖動(dòng)，組織消失，顯微鏡觀察是否有細(xì)胞，有大量的細(xì)胞時(shí)終止消化。收集上清液，800r/min離心5min，去酶液。加入新的KB液保存細(xì)胞。傳統(tǒng)方法：取心臟同上，迅速放入4℃肝素鹽水反復(fù)沖去除心腔內(nèi)殘血，心臟懸掛于Langendorff 灌流[8,9]。一個(gè)通道灌注高鉀液，使心臟停止機(jī)械搏動(dòng)，沿主動(dòng)脈將主動(dòng)脈切開。自制的導(dǎo)管通過主動(dòng)脈左冠狀動(dòng)脈竇插入左冠狀動(dòng)脈回旋支內(nèi)，竇口處縫合固定心臟。沿房室溝分別結(jié)扎心外膜冠狀動(dòng)脈右室支、左前分支及回旋支的心室各分支，根據(jù)結(jié)扎點(diǎn)剪去左、右心室組織，剪完后仍有多處部位漏液體，需要逐一結(jié)扎，直至肉眼看不到漏液點(diǎn)。另一個(gè)通道灌流無鈣臺(tái)式液5min，去除殘留的殘血及高鉀液。酶液循環(huán)灌流45～60min左右至心肌組織松弛呈溶膠狀。顯微鏡觀察灌流液內(nèi)可見數(shù)個(gè)心肌細(xì)胞時(shí)終止消化，無鈣臺(tái)式液灌流5min，沖洗殘余的酶液。疏松的心房肌放入無鈣臺(tái)式液中切碎，用寬口吸管勻速吹打多次。細(xì)胞的懸濁液用200目金屬濾網(wǎng)過濾至細(xì)胞保存液中(圖1)。

圖1 兩種不同方法分離心房肌細(xì)胞的步驟A.傳統(tǒng)方法；B.改良方法

5.細(xì)胞存活率的檢測(cè)：取心肌細(xì)胞懸液90μl加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液10μl均勻混合，已混勻的細(xì)胞懸液沿著蓋玻片邊緣滴入，將計(jì)數(shù)板放置于倒置相差顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，未著上色折光性強(qiáng)的圓形細(xì)胞為活的心肌細(xì)胞，染成藍(lán)色的為死細(xì)胞。隨機(jī)取4個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)心肌細(xì)胞的存活率(%)=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%，重復(fù)計(jì)數(shù)計(jì)算5次。

6.膜片鉗全細(xì)胞記錄：選取紋理清晰、桿狀、立體感和折光性強(qiáng)的細(xì)胞在室溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞加入細(xì)胞池中，貼壁后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。膜片鉗記錄兩種方法分離細(xì)胞的起搏電流，采用EPC10放大器和Pulse軟件進(jìn)行記錄和數(shù)據(jù)分析。細(xì)胞外液持續(xù)恒溫灌流細(xì)胞池。充滿電極內(nèi)液后電極阻抗為 2～4MΩ，使電極與細(xì)胞表面形成高阻封接后破膜，形成全細(xì)胞記錄模式，記錄全細(xì)胞If電流，觀察左心房細(xì)胞的電生理特性。

結(jié) 果

1.犬心房肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)：心房肌細(xì)胞在顯微鏡下觀察，改良方法獲得單個(gè)細(xì)胞呈細(xì)桿狀，狹長(zhǎng)，細(xì)胞膜表面光滑，橫紋清晰，立體感和折光性強(qiáng)，在靜息狀態(tài)下，細(xì)胞不發(fā)生自發(fā)性收縮；傳統(tǒng)方法分離的單個(gè)細(xì)胞呈桿狀或矩形，橫紋清晰，立體感不強(qiáng)多呈扁平狀，在靜息狀態(tài)下，細(xì)胞易發(fā)生自發(fā)性收縮，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞發(fā)生自發(fā)收縮，呈團(tuán)狀或橢圓形，成為死細(xì)胞。于細(xì)胞灌流槽底部的貼壁細(xì)胞，呈靜息狀態(tài)，結(jié)構(gòu)及橫紋均清晰，不發(fā)生自發(fā)性收縮，適用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)(圖2)。

圖2 兩種方法分離犬心房肌細(xì)胞A.改良方法分離細(xì)胞(×200);B.改良方法分離單個(gè)細(xì)胞(×400);C.傳統(tǒng)方法分離細(xì)胞(×200);D.傳統(tǒng)方法分離單個(gè)細(xì)胞(×400)

2.細(xì)胞的存活情況：改良方法分離的細(xì)胞存活率為83.33%±2.87%，室溫靜置1h后加入含1.8mmol/L鈣的細(xì)胞外液靜置1h后，細(xì)胞自發(fā)收縮率為20.17%±1.42%；傳統(tǒng)方法分離的細(xì)胞形態(tài)與上述相似，但細(xì)胞成活率約70.67%±2.88%，加鈣靜置1h后，27.83%±1.01%的細(xì)胞發(fā)生持續(xù)的自發(fā)收縮，死亡細(xì)胞過多，與改良后的方法比較貼壁細(xì)胞較少，膜片鉗實(shí)驗(yàn)操作基本可行。兩種方法比較，改良方法的細(xì)胞存活率顯著高于傳統(tǒng)方法 (P<0.05)，改良方法的細(xì)胞自發(fā)收縮率顯著低于傳統(tǒng)方法 (P<0.05，圖3)。

圖3 兩種方法分離犬心房肌細(xì)胞細(xì)胞存活與改良方法比較，*P<0.05

3.酶的使用量和酶消化時(shí)間：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞分離過程中都需要使用Ⅱ型膠原酶。兩種分離方法使用酶的量和酶消化時(shí)間是不同的，改良方法酶使用量為55.55±1.33mg，酶消化時(shí)間為38.50±2.02min；傳統(tǒng)方法酶使用量為72.50±0.99mg，酶消化時(shí)間為51.67±1.52min；改良方法使用膠原酶Ⅱ和酶消化時(shí)間均顯著少于傳統(tǒng)方法(P<0.05，圖4)。

圖4 分離犬心房肌細(xì)胞細(xì)胞酶使用情況與改良方法比較，*P<0.05

4.全細(xì)胞模式下記錄心肌細(xì)胞起搏電流：鉗制電位-40mV，給予指令測(cè)試電位逐漸降至-140mV，階躍10mV，鉗制時(shí)間2000ms。兩種方法每次分離的細(xì)胞中記錄同樣多細(xì)胞數(shù)，成功記錄電流的細(xì)胞數(shù)不同。并經(jīng)χ2檢驗(yàn)得出χ2值為23.69，P=0.000，改良方法中58.33%的細(xì)胞記錄到起搏電流，傳統(tǒng)方法中有32.78%的細(xì)胞記錄到電流，詳見表1。改良方法分離的細(xì)胞記錄的電流大并穩(wěn)定，而傳統(tǒng)方法分離細(xì)胞記錄電流相對(duì)較小且不穩(wěn)定(圖5)。

表1 兩種方法分離細(xì)胞和記錄電流的比較

圖5 兩種方法記錄到細(xì)胞起搏電流A.改良方法記錄電流;B.傳統(tǒng)方法記錄電流

討 論

離子通道的異?？烧T發(fā)心房顫動(dòng)。心臟信號(hào)電傳導(dǎo)主要利用鉀、鈉和鈣離子通道使得心肌細(xì)胞膜兩邊的電壓保持動(dòng)態(tài)平衡，如果失去這種平衡就易發(fā)生心律失常疾病。單個(gè)心肌細(xì)胞在離子通道疾病相關(guān)的研究中日益重要[10]。早期報(bào)道采用心臟剪切成小組織塊后進(jìn)行消化分離單個(gè)心肌細(xì)胞，但現(xiàn)在普遍采用Langendorff灌流急性分離大型動(dòng)物單個(gè)心肌細(xì)胞的方法[11～15]。為了能夠獲得高質(zhì)量的心肌細(xì)胞，其分離技術(shù)方法非常關(guān)鍵。本研究分離心房肌細(xì)胞的方法是在本實(shí)驗(yàn)室原有的方法上做了部分改進(jìn)[8,9]。

兩種方法的不同，主要是灌流溶液前心臟的處理方式，灌流溶液順序、消化酶的選擇，詳見表2。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程Langendorff 灌流系統(tǒng)穩(wěn)定，兩種方法在相同的水質(zhì)、 pH值、溫度條件下進(jìn)行。

表2 兩種方法的比較

取心臟時(shí)間到膠原酶灌流之間時(shí)間越短，細(xì)胞狀態(tài)越好[8,9]。改良方法先進(jìn)行組織的修剪，不用自制的托盤器，因組織小而減少試劑(灌流液)的使用、節(jié)約灌流的時(shí)間及結(jié)扎時(shí)間，可以縮短前期處理的時(shí)間保證細(xì)胞處于良好的狀態(tài)。鈣離子可以使心臟跳動(dòng)，所以用含鈣臺(tái)式液進(jìn)行灌流有效地去除心腔及血管內(nèi)積血。而細(xì)胞內(nèi)鈣超載，細(xì)胞持續(xù)收縮，細(xì)胞的能量大量消耗而死亡，所以含鈣臺(tái)式液灌流后快速用無鈣臺(tái)式液灌流去除鈣離子[16]。溫度對(duì)于酶消化過程非常重要，尤其心臟表面的溫度是心臟灌流是否良好的重要指標(biāo)。酶消化法分離細(xì)胞過程中最佳溫度在37℃左右，絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都是在35～37℃條件下進(jìn)行酶解的[17]。Langendorff 裝置的核心是多根多夫線圈，外護(hù)套由設(shè)置與水浴鍋相連從而進(jìn)行加熱。Langendorff裝置做了輕微的改變，本實(shí)驗(yàn)原有方法需要兩個(gè)灌流通道，一個(gè)灌流高鉀溶液，一個(gè)灌流酶液，改成一個(gè)灌流通道，流通時(shí)間變短，可以更好地保持通道內(nèi)的溫度，保證心臟表面的溫度。膠原酶消化組織的能力是眾所周知的，有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶有助于心肌細(xì)胞的分離。分離細(xì)胞過程中常加入牛血清白蛋白，主要是維持細(xì)胞的滲透壓和防止水腫。本實(shí)驗(yàn)參考 Pacioretty等[18]應(yīng)用的方法，酶液使用膠原酶Ⅱ、蛋白酶和牛血清白蛋白。蛋白酶和牛血清白蛋白兩種試劑可以保護(hù)細(xì)胞膜，減輕膠原酶對(duì)細(xì)胞膜的損傷。剪碎組織獲得的細(xì)胞中有大量的細(xì)胞碎片，影響細(xì)胞成活率以及離子電流的記錄，經(jīng)過改進(jìn)后有效減少細(xì)胞碎片，從而獲得質(zhì)量較好的單個(gè)心房肌細(xì)胞。

綜上所述，兩種方法分離犬心房肌細(xì)胞比較，改良方法對(duì)實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行優(yōu)化和改良，獲得高質(zhì)量、高數(shù)量的單個(gè)心房肌細(xì)胞。該方法操作簡(jiǎn)便有效，重復(fù)性強(qiáng)，總體時(shí)間縮短，節(jié)約試劑，細(xì)胞成活率高，細(xì)胞形態(tài)完整，進(jìn)行電流的記錄比較完整，更適合于膜片鉗實(shí)驗(yàn)對(duì)離子通道疾病的研究，同時(shí)也適合其他大型動(dòng)物分離心肌細(xì)胞。