晉靜靜 陳鳳輝 古再努爾·阿迪力 程祖亨 邱長春 瑪依拉·吾甫爾

衰老是生物體長期進化的結果，由基因和環(huán)境共同作用，揭示衰老調(diào)控機制，實現(xiàn)長壽是生命科學的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素影響壽命的決定度占25%，環(huán)境因素占70%，但由于環(huán)境因素的隨機性，且遺傳因素差異是造成個體對環(huán)境作出不同反應能力的主要因素[1,2]。因此探究遺傳因素有助于揭示基因控制長壽表型，闡明長壽調(diào)控機制，實現(xiàn)長壽。新疆維吾爾自治區(qū)和田地區(qū)長壽人群是目前研究長壽的公認群體，本課題組前期研究表明發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E和糖皮質(zhì)激素受體等基因與新疆維吾爾自治區(qū)和田地區(qū)長壽具有顯著相關性[3～5]。然而長壽是由多種基因共同作用的復雜性狀，故針對該地區(qū)長壽群體單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)進行全基因組關聯(lián)分析(genome-wide association study， GWAS)，對于篩選長壽相關SNP易感位點具有重要意義。因此本研究針對新疆維吾爾自治區(qū)和田地區(qū)長壽群體進GWAS，旨在探究長壽強相關基因與健康狀況的相關性。

資料與方法

1.一般資料：選擇2012年2月～2015年2月新疆維吾爾自治區(qū)和田地區(qū)維吾爾族長壽人群(納入標準[6]：年齡≥90歲者)122例為長壽組，同時納入該地區(qū)同期非長壽人群(納入標準[6]：隨訪3代以內(nèi)，家族人群年齡均<90歲者)98例為對照組，兩組研究人群的排除標準：①外地遷移至此的人群；②因人口流動或失聰、失明、失語導致無法有效完成隨訪者；③合并精神疾病或認知障礙者；④未簽署知情同意書者。其中長壽組患者年齡為91～109歲，平均年齡為99.74±8.48歲；長壽組中男性55例，女性67例；飲酒者23例，非飲酒者99例；小學及以下學歷者99例，初中學歷者14例，高中及以上學歷者9例。對照組患者年齡為61～73歲，平均年齡為66.35±7.83歲；99例患者中，男性44例，女性54例；飲酒者16例，非飲酒者80例；小學及以下學歷者81例，初中學歷者11例，高中及以上學歷者6例。兩組患者性別、是否飲酒以及學歷等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.長壽強相關基因的GWAS：為篩選與長壽強相關的SNP位點，本課題組抽取研究對象的靜脈血5ml，采用 pooling DNA 雜交對長壽組/對照組的全基因組掃描差異；通過Affymetrix SNP 6.0 芯片雜交技術完成了基于 pooling DNA 的研究人群SNP 分型分析，篩選出可能與長壽相關的SNP位點；同時應用 Sequenom Mass Array 技術平臺(Sequenom Chipll-G384芯片)對可能與壽命相關的SNP位點進行分型分析，完成對于長壽強相關基因驗證。長壽強相關的SNP的判斷標準參考文獻[7]，應用Logistic分析，以OR≥4.00，P<0.05為強正相關。

3.健康資料統(tǒng)計：測量研究對象的體重指數(shù)(body mass index, BMI)、空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)水平、收縮壓(systolic blood pressure, SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)以及測定血清總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C) 以及高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)等血脂水平。

結 果

1.長壽強相關基因的GWAS的比較：本研究通過Affymetrix SNP 6.0 芯片對研究對象進行GWAS發(fā)現(xiàn)兩組之間有42個SNP位點存在差異(P<0.05)，隨后將這42個SNP位點應用 Sequenom Mass Array 技術平臺將進行群體驗證發(fā)現(xiàn)rs4449651 TT基因型(OR=5.168，P=0.026)、rs1718307 TT基因型(OR=5.469，P=0.002)、rs4316818 TT基因型(OR=4.193，P=0.006)以及rs2834384 GG型(OR=4.744，P=0.025)與長壽呈強相關性，詳見表1。

表1 長壽強相關基因的GWAS[n(%)]

LAMA2.層粘連蛋白α2；PAH.苯丙氨酸羥化酶；ACE3.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-3；MRPS6.線粒體核糖體蛋白-S6

2.健康相關指標比較：通過隨訪調(diào)查研究對象的健康相關指標，本研究發(fā)現(xiàn)長壽組人群BMI、FBG、TG、TG以及LDL-C水平降低，而HDL-C水平，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),兩組人群SBP及DBP比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表2。

表2 兩組研究對象的健康相關指標比較

Δ1mmHg=0.133kPa

3.健康指標與強相關基因多重線性回歸：將BMI、FBG、TC、TG、HDL-C以及LDL-C健康相關指標分別作為應變量，將rs4449651(基因型設置啞變量：AA=1，AT=2，TT=3)、rs1718307(基因型設置啞變量：AA=1，AT=2，TT=3)、rs4316818(基因型設置啞變量：CC=1，CT=2，TT=3)以及rs2834384(基因型設置啞變量：TT=1，GT=2，GG=3)作為自變量，采用多重線性回歸分析健康相關指標與基因型之間的依存關系。BMI和rs4449651、rs1718307、rs4316818以及rs2834384均具有相關性(P<0.05)，F(xiàn)BG水平與rs4449651及rs1718307具有相關性(P<0.05)，TC水平則與rs1718307、rs4316818以及rs2834384呈相關性(P<0.05)，TG水平與rs2834384呈相關性(P<0.05)，而HDL-C以及LDL-C則與ACE基因rs4316818位點以及MRPS6基因rs2834384位點呈相關性(P<0.05)，詳見表3。

表3 健康指標與強相關基因多重線性回歸

討 論

揭示長壽基因變異度是目前生命科學研究熱點，然而目前有關長壽基因的研究多局限于單一基因的，而長壽是由遺傳及環(huán)境因素控制的復雜的生物表型，受多基因累積控制，GWAS是在全基因組范圍內(nèi)篩選出與生物表型相關的SNP的檢測手段[8]。因此本課題組采用GWAS進行多基因整合研究，探究了健康表型與SNP位點的相關性，揭示了長壽與多基因效應之間的關系。

本研究通過Affymetrix SNP 6.0 芯片雜交技術完成研究對象的可疑長壽相關SNP位點篩選，同時應用 Sequenom Mass Array 技術平臺完成驗證確定出與研究人群長壽的強相關SNP易感位點，筆者研究發(fā)現(xiàn)，LAMA2基因 rs4449651 TT基因型、PAH 基因rs1718307 TT基因型、ACE3基因rs4316818 TT基因型以及MRPS6基因 rs2834384 GG型共4個基因型存在強相關性，這與國外研究者Karimov等[9]的研究結論較為一致。同時筆者查閱相關文獻發(fā)現(xiàn)LAMA2基因是編碼細胞外基質(zhì)的主要基因，其Alu(I/D) 多態(tài)位點變異同樣影響人群壽命[8,10]。Szpakowicz等[11]研究則表明MRPS6基因SNP位點與心肌梗死的發(fā)生率及預后效果有關，該基因SNP位點變異可導致心肌梗死發(fā)生率增加。而PAH基因可表達苯丙氨酸羥化酶，該基因變異是導致苯丙酮尿癥的主要原因[12]。但目前有關PAH基因與長壽之間關系的報道較少，仍需進一步探究。

血糖升高是心腦血管疾病的危險因素，本課題組通過采集研究對象的健康相關指標，發(fā)現(xiàn)長壽組人群BMI及FBG水平較低，這提示長壽人群健康狀況優(yōu)于對照組人群，同時筆者采用多重線性回歸發(fā)現(xiàn)上述健康相關指標分別受1種及以上長壽相關基因控制，這不僅提示長壽是多種基因的累積效應，同時也表明GWAS進行多基因整合研究對于揭示長壽機制的重要性。血糖水平升高則引起微血管病變，引起B(yǎng)MI升高，是導致心腦血管及代謝性老年疾病的重要原因[13]。本研究發(fā)現(xiàn)BMI與LAMA2、PAH、ACE3及MRPS6基因均具有相關性，同時FBG與LAMA2及PAH具有相關性。查閱文獻筆者發(fā)現(xiàn)，ACE3可通過減輕胰腺細胞氧化應激以及調(diào)節(jié)胰島細胞微環(huán)境，達到提高胰島β細胞功能的作用，而MRPS6則通過調(diào)節(jié)糖脂代謝達到穩(wěn)定血糖的效果[14，15]。因此LAMA2及PAH 可能通過調(diào)節(jié)并優(yōu)化了體內(nèi)血糖代謝系統(tǒng)，減少了血糖相關疾病的發(fā)生，進而影響了長壽。

血脂代謝紊亂導致心腦血管動脈粥樣硬化等疾病，是引起老年群體死亡的重要原因[16,17]。本課題發(fā)現(xiàn)長壽組人群TG、TG以及LDL-C水平降低，而HDL-C水平升高，這提示長壽人群的血脂代謝優(yōu)于對照組，同時本研究結果表明TG、TG、LDL-C以及HDL-C水平與ACE3及MRPS6基因均呈相關性。而國內(nèi)有研究者同樣研究發(fā)現(xiàn)，ACE基因SNP位點與長壽現(xiàn)象之間密切相關，與本課題GWAS結果一致。而流行病學研究表明，MRPS6基因可降低心肌梗死等心臟疾病的發(fā)生。而本研究表明MRPS6基因可調(diào)節(jié)血脂系統(tǒng)平衡，這是解釋MRPS6基因可降低心臟相關疾病發(fā)生，延長壽命的潛在機制。

綜上所述，本研究通過GWAS進行多基因整合研究，發(fā)現(xiàn)LAMA2基因 rs4449651、PAH 基因rs1718307、ACE3基因rs4316818以及MRPS6基因 rs2834384共4個基因型與長壽呈強相關性，同時與研究人群的BMI、血糖以及血脂等健康指標呈相關性。