胡淵龍 劉繼法 成曉萌 邱占軍

（1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014）

膿毒癥是重癥患者死亡的主要原因之一，有研究顯示，每年全球約3 150萬人患膿毒癥，530萬患者死亡，腎損傷是其高死亡率的原因之一[1]。中醫(yī)學認為，膿毒癥的病機是毒熱、瘀血、虛損及腑氣不通共同造成的結果[2-3]，其中瘀血是其發(fā)生發(fā)展的始動因素[4]。根據活血化瘀理論開發(fā)的血必凈注射液被證實可以降低炎癥因子水平，改善膿毒癥誘導的腎損傷程度[5-6]。炎癥因子一直被認為是治療和預防膿毒癥腎損傷有希望的藥物靶點[7]，也是活血化瘀中藥的作用靶點[8]。銀杏葉具有活血化瘀、斂肺澀腸之功效，主要用于心血管疾病的治療?；诖?，我們推測銀杏葉提取物可以通過活血化瘀在膿毒癥中保護腎臟，其機制是降低炎癥因子水平。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠16只，體質量300～400 g，由山東大學實驗動物中心提供[SCXK（魯）2013-0009]。所有大鼠飼養(yǎng)于山東省醫(yī)學科學院山東省實驗動物中心[SYXK（魯）2018-0007]。飼養(yǎng)條件：室溫22～24℃，相對濕度50%～60%，光照12 h。實驗前用標準食物和水適應性喂養(yǎng)7 d。

1.2 試藥與儀器 銀杏葉提取物[銀杏達莫注射液（國藥準字H52020032），貴州益佰制藥股份有限公司]購自濟南市中醫(yī)院，每5毫升含銀杏總黃酮4.5～5.5 mg。大鼠白細胞介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫試劑盒（上海博蘊生物科技有限公司），大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫試劑盒（上海博蘊生物科技有限公司），尿素氮（BUN）測試盒（脲酶法，南京建成生物工程研究所），肌酐（Cr）測定試劑盒（肌氨酸氧化酶法，南京建成生物工程研究所）。Multiskan Go全波長酶標儀（美國Thermo Fisher公司），ELx50自動洗板機（美國BioTek公司），TGL-16B8高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.3 分組與造模 將所有大鼠稱重、編號，按隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為4組：假手術組（假手術后0.5 h注射0.9%氯化鈉溶液），膿毒癥組（CLP造模后0.5 h注射0.9%氯化鈉溶液），預防組（CLP造模前6 h注射銀杏達莫注射液），治療組（CLP后0.5 h注射銀杏達莫注射液），每組4只大鼠。造模方法：各組均采用盲腸穿刺結扎法（CLP）[9]建立膿毒癥大鼠模型。主要步驟如下：以10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉。在大鼠的前腹部行剖腹手術，逐層打開腹腔，左下腹游離系膜與盲腸，用無菌絲線環(huán)形結扎盲腸根部，將結扎部位用16號針頭對穿1次，輕輕從穿孔部位擠出少量糞便，還納腸管，用無菌絲線逐層縫合關腹，消毒切口。假手術組打開腹腔，翻動盲腸，不做穿刺結扎處理，放回腹腔，逐層縫合腹壁切口。手術結束后，頸后皮下注射預熱0.9%氯化鈉溶液進行復蘇。

1.4 標本采集與檢測 按實驗分組分別將造模后12 h的大鼠再次以10%的水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉。自腹主動脈抽取全血標本5 mL，置于促凝采血管中，用離心機3 000 r/min離心15 min，取4份上清液置于EP管中，每份樣品為0.5 mL，置于-80℃低溫冰箱保存，待行血清檢測。血清由-80℃取出后，放于4℃完全復溶。嚴格按照試劑盒說明，用ELISA測定4個組大鼠血清中TNF-α與IL-6濃度，樣本的吸光度應在標準曲線的范圍之內。脲酶法測定血清尿素氮濃度，肌氨酸氧化酶法測定血清肌酐濃度。半柔性分子模擬對接：通過TCMSP數(shù)據庫篩選類藥性（DL）大于0.18的黃酮類藥物活性成分。利用AutoDock Vina對4種黃酮類有效成分進行半柔性分子對接，將受體IL-6與TNF-α設置為剛性分子，將配體設置為柔性分子，最大結合自由能設置為-4，最大結合構象數(shù)量設置為9。以結合自由能最低的構象作為最佳結合構象。應用PyMOL對最佳構象進行可視化。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用ELISACalc V0.2擬合標準曲線方程，擬合模型選用logistic曲線（四參數(shù)），并計算IL-6與TNF-α濃度。其余統(tǒng)計學處理均在R 3.6.0與Rstudio中完成。采用Shapiro-Wilk法檢驗數(shù)據分布。多組間數(shù)據的比較，若資料滿足正態(tài)分布和方差齊，則采用方差分析進行組間比較，如果組間差異有統(tǒng)計學意義，進一步采用TukeyHSD法進行兩兩比較。如果不服從正態(tài)分布，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。采用ggplot2包進行數(shù)據可視化。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎損傷指標尿素氮、肌酐水平比較 見表1。與假手術組相比，預防組、治療組、膿毒癥組BUN、Cr均顯著升高（P＜0.05）。與膿毒癥組相比，預防組與治療組的BUN、Cr均顯著降低（P＜0.05）。而預防組與治療組相比，BUN、Cr均顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠腎損傷指標BUN、Cr與炎癥指標IL-6、TNF-α水平比較（±s）

表1 各組大鼠腎損傷指標BUN、Cr與炎癥指標IL-6、TNF-α水平比較（±s）

與假手術組比較，?P＜0.05；與膿毒癥組比較，△P＜0.05；與治療組比較，#P＜0.05

組別膿毒癥組預防組治療組假手術組n 4 4 4 4 BUN（mmol/L）30.27±2.15*17.46±1.08*△#27.06±4.97*△10.98±0.74 Cr（μmol/L）134.81±7.37*70.88±3.64*△#98.57±11.97*△37.71±9.26 IL-6（ng/L）46.86±0.52*29.58±1.20*△#36.41±1.01*△11.45±2.58 TNF-α（ng/L）94.84±3.47*52.68±3.19*△#35.44±3.17*△69.69±4.75

2.2 各組大鼠炎癥指標IL-6、TNF-α水平比較 見表1。IL-6擬合曲線R2=0.994，TNF-α擬合曲線R2=0.999，均符合標準曲線要求。12 h后，各組大鼠血清IL-6、TNF-α相比較具有顯著差異（P＜0.05）。與假手術組相比，預防組、治療組、膿毒癥組IL-6、TNF-α均顯著升高（P＜0.05）。與膿毒癥組相比，預防組與治療組的IL-6、TNF-α均顯著降低（P＜0.05）。而預防組與治療組相比，IL-6、TNF-α均顯著降低（P＜0.05）。

2.3 黃酮類活性成分模擬分子對接 見表2，圖1。對銀杏葉提取物中黃酮類化合進行篩選，發(fā)現(xiàn)銀杏雙黃酮（Ginkgetin）、山柰素（Kaempferol）、槲皮素（Querci?trin）和異鼠李素（Isorhamnetin）4種活性成分。4種成分類藥性分別為銀杏雙黃酮0.59、山柰素0.24、槲皮素0.74、異鼠李素0.31。通過半柔性對接后，發(fā)現(xiàn)4種黃酮成分均可以與TNF-α、IL-6較好地結合，結合自由能均≤-7。

表2 各構象結合自由能（kcal/mol）

圖1 最佳構象模式圖

3 討 論

我們發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物可以降低膿毒癥大鼠的腎損傷標志物，且能降低血清IL-6與TNF-α水平，說明其可以通過降低炎癥因子發(fā)揮抗炎作用，從而在膿毒癥中保護腎臟。進一步通過分子模擬技術發(fā)現(xiàn)，4種黃酮類活性成分均可以與IL-6與TNF-α結合，說明銀杏葉提取物抑制炎癥的機制可能是通過結合炎癥因子的方式實現(xiàn)的。

中醫(yī)學認為膿毒癥的基本病機是正虛毒損，瘀滯絡脈，其中瘀血是其病機核心。膿毒癥患者往往既有正氣虛損，亦有毒邪內蘊。虛實錯雜，毒邪深入血分，與血互結，形成瘀血。瘀血阻滯，臟腑受損。另一方面，臟腑受損，血行不暢，以致成瘀。最終瘀毒互結，臟腑受損難復。倪永騁等學者發(fā)現(xiàn)氣滯血瘀證患者血清TNF-α、IL-6水平顯著增高[10]。即使Sepsis3.0診斷標準摒棄了SIRS標準轉而采用SOFA評分，但機體炎癥反應依然是其概念內涵的核心，這又說明了過度炎癥反應是造成器官損傷的重要機制[11-13]。而TNF-α與IL-6無疑是膿毒癥炎癥機制中重要的促炎因子[14-15]與生物標志物[16]，也是膿毒癥誘導腎損傷的重要機制[17-18]。

早在2006年，就有研究報道，抑制TNF-α相關通路可減少膿毒癥動物模型中的急性腎損傷。一項2014年的Meta分析結果顯示，抗TNF-α單克隆抗體療法可以降低膿毒癥的死亡率[19]。IL-6無論是作為診斷膿毒癥生物學標志還是在預測膿毒癥患者預后方面都具有不可替代的地位[20]。另一項Meta分析也顯示IL-6是膿毒癥的診斷標志物[21]。膿毒癥患者血清IL-6水平可以維持較長時間，所以選擇IL-6作為治療靶點比其他細胞因子擁有長的治療窗，這正是使用IL-6抑制劑治療膿毒癥的優(yōu)勢所在[22]。

總的來說，基于瘀血理論和現(xiàn)代中藥藥理研究，我們推測銀杏葉可以通過活血化瘀的功效在膿毒癥中保護腎臟，其機制在于降低炎癥因子水平。通過動物實驗檢測銀杏葉提取物干預后的膿毒癥急性腎損傷模型的BUN、Cr、TNF-α、IL-6水平，說明了銀杏葉提取物可以改善膿毒癥急性腎損傷，進一步通過分子模擬對接技術揭示了藥物治療的潛在機制是通過與炎癥因子TNF-α、IL-6結合減少炎癥反應，從而減輕了膿毒癥急性腎損傷，這有待于進一步研究明確其具體機制。