閆振文 鄭眉光 李 梅

（中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

急性腦梗死（ACI）系指腦缺血發(fā)生在6～12 h之內(nèi)，缺血區(qū)腦組織會(huì)產(chǎn)生病理改變，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的缺血變化。腦細(xì)胞缺血缺氧后，腦組織將會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)等一系列病理反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量氧自由基和炎性因子，使蛋白質(zhì)、氨基酸、脂質(zhì)等過氧化，產(chǎn)生細(xì)胞毒性并破壞血腦屏障，進(jìn)一步加重腦損傷，導(dǎo)致大腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞凋亡[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腦組織缺血后，自由基可通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[2]。目前，臨床對(duì)ACI的治療主要以恢復(fù)血供、增加氧再灌注水平為原則，以減輕甚至避免因缺血缺氧導(dǎo)致的腦組織損傷，最大限度地保護(hù)腦組織。常規(guī)治療以溶栓、抗凝、抗血小板聚集等方法為主，尤其是靜脈溶栓，被醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為挽救缺血腦組織的重要方法，但均無法及時(shí)清除氧自由基等物質(zhì)[3]。

急性腦梗死在中醫(yī)學(xué)上屬“內(nèi)風(fēng)”范疇，為內(nèi)傷病證。中醫(yī)認(rèn)為誘發(fā)中風(fēng)的病因主要有機(jī)體腑臟失調(diào)、情志郁怒、飲食不節(jié)、勞累過度、氣候改變等，其病機(jī)多以氣血運(yùn)行不暢、瘀血阻脈、久瘀化熱最常見，故治療時(shí)應(yīng)以活血化瘀、行氣通絡(luò)為主[4]。益氣活血通絡(luò)方以黃芪、黨參為君藥，以當(dāng)歸、丹參、川芎為臣藥，具有益氣固表、活血化瘀、行氣解毒通絡(luò)的功效，適用于中風(fēng)。本研究通過復(fù)制SD大鼠急性腦梗死模型，旨在探討益氣活血通絡(luò)方對(duì)急性腦梗死模型大鼠相關(guān)炎癥因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只清潔級(jí)雄性SD大鼠，7～8周齡，平均體質(zhì)量（250±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-（京）2010-0015，合格證號(hào)：110011191100312。所有動(dòng)物室溫飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。

1.2 藥物與試劑 益氣活血通絡(luò)方，組成：黃芪30 g，黨參30 g，川芎10 g，當(dāng)歸10 g，丹參10 g，赤芍10 g，紅花10 g，桃仁15 g，地龍10 g，甘草6 g。上述中藥飲片均由本院中藥房提供，藥材加水煎煮2次，合并藥液共200 mL，生藥含量0.7 g/mL。注射用尿激酶（廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)20190521，規(guī)格25萬單位）；阿司匹林腸溶片（拜阿司匹林，沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司，批號(hào)20190323，規(guī)格100 mg）；硫酸氫氯吡格雷片（帥信樂普藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20180715，規(guī)格75 mg）；依達(dá)拉奉注射液（國藥集團(tuán)國瑞藥業(yè)有限公司，批號(hào)91130117，規(guī)格30 mg/20 mL）；水合氯醛（分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）；蘇木精-伊紅染色液（武漢華美生物工程有限公司）；白細(xì)胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、S100B蛋白試劑盒購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 RM2235型病理切片機(jī)，德國萊卡公司；BX60顯微鏡，日本Olympus Optical公司；LDZ-2型低速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；AU5400全自動(dòng)生化分析儀，日本奧林巴斯有限公司；ELx800酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.4 模型制備 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組10只、假手術(shù)組10只、手術(shù)組30只。參照Zealand-Longa線栓法[5]復(fù)制大腦中動(dòng)脈缺血模型（MCAO）。將手術(shù)組30只大鼠用5%水合氯醛（400 mg/kg）行腹腔麻醉，將實(shí)驗(yàn)大鼠側(cè)臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸正中線切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，分別結(jié)扎頸外動(dòng)脈與頸總動(dòng)脈。在頸總動(dòng)脈分叉下方開一切口，將線栓從切口處插入頸內(nèi)動(dòng)脈，有明顯阻力感時(shí)停止插入，剪去線栓尾端部分，并在頸內(nèi)動(dòng)脈根部固定，逐層縫合皮下組織及皮膚。術(shù)后腹腔注射2萬單位青霉素，大鼠保持側(cè)臥位，體溫維持在37℃左右，注意吸痰保持呼吸道通暢。動(dòng)物清醒后明顯有對(duì)側(cè)Horner征及偏癱體征，包括：1）身體向左傾倒或轉(zhuǎn)圈；2）左側(cè)軀體對(duì)疼痛刺激無反應(yīng)；3）提尾懸空時(shí)左前肢前伸現(xiàn)象消失；顯示造模成功。神經(jīng)功能缺損評(píng)分1～3分為合格，不合格者剔除。假手術(shù)組10只大鼠將栓線由ECA斷端插入ICA，保留約1 min后將栓線拔出，結(jié)扎ECA斷端，其余步驟同模型組。

1.5 分組及給藥 成模大鼠分為模型組、西藥組、聯(lián)合組（西藥組+益氣活血通絡(luò)方），于建模后第10日開始給藥。對(duì)照組、假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水灌胃，劑量為5 mL/kg。西藥組給予注射用尿激酶靜滴，劑量5萬U/kg；阿司匹林腸溶片和氯吡格雷灌胃，劑量各1 mg/kg；依達(dá)拉奉靜滴，劑量0.15 mg/kg。聯(lián)合組在西藥組基礎(chǔ)上給予益氣活血通絡(luò)方灌胃，劑量5 mL/kg。各組均每天灌胃1次，連續(xù)治療10 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）炎癥因子測(cè)定：于末次給藥后，心臟取血，離心，取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定各組大鼠血清IL-8和TNF-α水平，嚴(yán)格按說明書操作。2）氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定：心臟取血，離心，取上層血清，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定各組大鼠SOD水平，采用ELISA測(cè)定MDA水平，嚴(yán)格按說明書操作。3）神經(jīng)功能指標(biāo)測(cè)定：心臟取血，離心，取上層血清，采用放射免疫法檢測(cè)血清S100B蛋白、BDNF水平，嚴(yán)格按說明書操作。4）腦組織病理切片：末次給藥后處死各組大鼠，4℃下快速斷頭取腦，0.9%氯化鈉注射液清洗后，置于4%多聚甲醛中固定48 h，二甲苯脫脂，酒精梯度脫水，石蠟包埋，切片，每片厚約5 μm，蘇木精-伊紅染色，觀察各組大鼠的腦組織病理變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表表示，組間或組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)；采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)數(shù)資料的比較，以n（%）表示計(jì)數(shù)資料。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織病理學(xué)比較 見圖1。各組大鼠腦組織病理學(xué)切片顯示：聯(lián)合組少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞死亡，細(xì)胞質(zhì)疏松及腫脹明顯減輕；西藥組細(xì)胞核少見固縮，腦組織水腫有減輕；模型組腦組織周圍神經(jīng)元腫脹并出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞核固縮，梗死灶內(nèi)細(xì)胞和血管壞死，正常組織消失，結(jié)構(gòu)模糊、間質(zhì)水腫；對(duì)照組及假手術(shù)組細(xì)胞形態(tài)正常，分布均勻，未見皮質(zhì)部蒼白梗死。

圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)切片（HE染色，400倍）

2.2 各組炎癥因子水平比較 見表1。對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠的IL-8、TNF-α水平相比無明顯差異（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，模型組IL-8、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和聯(lián)合組IL-8、TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05）；與西藥組比較，聯(lián)合組IL-8、TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠IL-8、TNF-α水平比較（ng/L，±s）

表1 各組大鼠IL-8、TNF-α水平比較（ng/L，±s）

與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。下同

TNF-α組別n IL-8 6.14±0.86 6.82±1.04 22.31±1.58*11.59±1.25*#8.37±1.12#△對(duì)照組假手術(shù)組模型組西藥組聯(lián)合組10 10 10 10 10 18.40±3.91 19.12±4.03 43.52±15.48*30.36±12.35*#22.27±9.56#△?

2.3 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見表2。對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠的SOD、MDA水平比較無明顯差異（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，模型組SOD水平顯著降低、MDA水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和聯(lián)合組SOD水平均顯著升高、MDA水平均顯著降低（P＜0.05）；與西藥組比較，聯(lián)合組SOD水平顯著升高、MDA水平明顯降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠SOD、MDA水平比較（±s）

表2 各組大鼠SOD、MDA水平比較（±s）

組別對(duì)照組假手術(shù)組模型組西藥組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10 SOD（U/L）138.41±8.03 137.36±8.17 74.52±5.28*100.86±6.42*#123.77±7.86#△MDA（μmol/L）6.14±0.87 6.79±0.94 21.64±1.36*11.32±1.23*#8.27±1.02#△

2.4 各組神經(jīng)功能指標(biāo)比較 見表3。對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠的S100B、BDNF水平比較無明顯差異（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組BDNF水平顯著降低、S100B水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和聯(lián)合組BDNF水平均顯著升高、S100B水平均明顯降低（P＜0.05）；與西藥組比較，聯(lián)合組血清BDNF水平明顯升高、S100B水平顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠S100B、BDNF水平比較（ng/mL，±s）

表3 各組大鼠S100B、BDNF水平比較（ng/mL，±s）

組別對(duì)照組假手術(shù)組模型組西藥組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10 S100B 0.54±0.17 0.58±0.15 2.52±0.28*1.46±0.23*#0.83±0.19#△BDNF 6.82±0.31 6.75±0.34 2.73±0.46*4.32±0.38*#5.94±0.22#△

3 討 論

急性腦梗死具有發(fā)病急、致殘率和死亡率均較高而治愈率低等特點(diǎn)[6]，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。ACI發(fā)病后腦組織會(huì)發(fā)生不可逆損傷，嚴(yán)重者還可能出現(xiàn)腦組織缺血性壞死，易引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)功能性異常[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血性損傷的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)均密切相關(guān)[8]。氧化應(yīng)激系指機(jī)體受到刺激后，氧化和抗氧化能力失衡，傾向于氧化，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，進(jìn)而產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，是自由基大量堆積所致的負(fù)作用，其和炎癥通常緊密相連、相伴而生[9]。研究證明，氧自由基的大量堆積是引發(fā)急性缺血性神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要原因之一[10]，所以有效減少氧自由基，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)并抑制炎性反應(yīng)是治療急性腦梗死的重要手段。SOD作為體內(nèi)重要的抗氧化酶，是氧自由基的自然天敵，是清除氧自由基的頭號(hào)物質(zhì)，可對(duì)抗甚至逆轉(zhuǎn)氧自由基對(duì)細(xì)胞的損害，修復(fù)自由基引起的細(xì)胞損傷。有研究表明，SOD能通過磷酸化AKT減弱缺血損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[11]。

當(dāng)生物體內(nèi)產(chǎn)生大量的氧自由基時(shí)，會(huì)大量消耗SOD，使SOD水平降低；而MDA是由細(xì)胞膜中脂質(zhì)氧化后形成的，是氧化應(yīng)激反應(yīng)與氧自由基升高的重要標(biāo)志物，因此MDA水平的高低直接反映了生物體內(nèi)氧自由基的水平以及氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度，是評(píng)估氧自由基水平及氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)[12]。目前臨床已逐漸重視腦缺血早期對(duì)腦組織的炎性損傷，意識(shí)到IL-8和TNF-α等炎癥因子在誘發(fā)炎性反應(yīng)的過程中起著重要作用[13]。其中IL-8屬于趨化因子家族的一種細(xì)胞因子，利于趨化免疫效應(yīng)細(xì)胞，通過對(duì)中性粒細(xì)胞的細(xì)胞趨化作用而實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，并能促使多種生物活性物質(zhì)釋放[14]。TNF-α是一種單核因子，屬前炎細(xì)胞因子，主要由活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬，誘導(dǎo)肝細(xì)胞急性期蛋白合成，是重要的炎癥因子，且IFN-γ對(duì)TNF-α的生成有刺激作用。當(dāng)腦組織缺氧缺血時(shí)，TNF-α水平將會(huì)升高，并能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-8，引發(fā)炎性反應(yīng)，進(jìn)而相互影響，共同作用造成細(xì)胞損害[15]。因此，有效降低IL-8和TNF-α等炎癥因子水平對(duì)減輕炎性反應(yīng)、控制炎性損傷有重要意義。

S100B蛋白是一種腦特異蛋白，主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞、垂體前葉細(xì)胞。當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)，S100B蛋白的釋放量會(huì)明顯增加，并進(jìn)一步刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性因子及NO，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡而損傷神經(jīng)功能，因而S100B蛋白水平的高低與急性腦缺血損傷的程度密切相關(guān)[16]。BDNF是在腦內(nèi)合成的一種內(nèi)源性腦神經(jīng)營養(yǎng)因子，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)，對(duì)神經(jīng)元的分化和生長再生具有維持和促進(jìn)作用。ACI發(fā)病后，在神經(jīng)元損傷的早期，BDNF釋放量會(huì)顯著增加，以保護(hù)神經(jīng)功能[17]；但后期，當(dāng)神經(jīng)元損傷因素持續(xù)大量存在時(shí)，會(huì)過度消耗BDNF，同時(shí)還能使BDNF合成減少，導(dǎo)致生物體內(nèi)BDNF水平降低。故提高BDNF水平對(duì)減輕腦缺血損傷后期神經(jīng)元損傷，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡有著重要作用。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為ACI屬于“中風(fēng)病”范疇，其病機(jī)主要為氣血不足、血瘀阻絡(luò)，多因氣滯血行不暢或氣虛運(yùn)血無力，導(dǎo)致腦絡(luò)痹阻而引發(fā)該病，因此益氣活血、行氣祛瘀通絡(luò)是治療該病的基本原則[18]。益氣活血通絡(luò)方以黃芪、黨參為君藥，益氣固表、補(bǔ)氣升陽；配以當(dāng)歸、丹參、川芎，活血化瘀、行氣止痛、祛風(fēng)通絡(luò)；加赤芍、紅花、桃仁、地龍，以破血逐瘀、清熱涼血、通經(jīng)活絡(luò)；配甘草以補(bǔ)脾益氣、緩急解毒、調(diào)和諸藥，達(dá)到益氣活血、化瘀通絡(luò)的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[19-20]，丹參可改善血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，且具有抗炎作用，能減輕炎癥因子對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷，并促進(jìn)組織修復(fù)再生，從而恢復(fù)神經(jīng)功能；川芎能抑制血小板聚集，增強(qiáng)纖溶系統(tǒng)活性，產(chǎn)生抗血栓作用，還能擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抑制神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促使中樞神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)，保護(hù)缺血損傷的神經(jīng)細(xì)胞；當(dāng)歸、紅花能抗血小板聚集，并擴(kuò)血管改善微循環(huán)，保護(hù)腦神經(jīng)元；赤芍能緩解腦缺血后引起的腦組織損傷；桃仁可抗血栓形成；地龍中含有纖維蛋白酶和纖維蛋白原激活酶，具有一定的溶栓作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)組和假手術(shù)組大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)相比較，無顯著差異。與對(duì)照組比較，模型組IL-8、TNF-α水平顯著升高；與模型組比較，西藥組和聯(lián)合組IL-8、TNF-α水平顯著降低；與西藥組對(duì)比，聯(lián)合組各指標(biāo)顯著降低。與對(duì)照組比較，模型組SOD水平顯著降低、MDA水平顯著升高；與模型組比較，西藥組和聯(lián)合組SOD水平均顯著升高、MDA水平均顯著降低；與西藥組比較，聯(lián)合組SOD水平顯著升高、MDA水平顯著降低。與對(duì)照組比較，模型組BDNF水平顯著降低、S100B水平顯著升高；與模型組比較，西藥組和聯(lián)合組BDNF水平均顯著升高、S100B水平均顯著降低；與西藥組比較，聯(lián)合組BDNF水平顯著升高、S100B水平顯著降低。結(jié)果表明益氣活血通絡(luò)方能有效減輕炎癥，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，保護(hù)腦組織。

綜上所述，益氣活血通絡(luò)方可降低急性腦梗死模型大鼠IL-8、TNF-α等炎癥因子水平，減輕炎性反應(yīng)；能有效升高SOD水平并降低MDA水平，改善氧化應(yīng)激反應(yīng)；能緩解神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，保護(hù)缺血損傷腦組織。