劉子菁 張嘉文 姜沛彧 尹 智 劉韻祎劉乙萱 王小燕 劉文濤 許 陽

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，南京，210029；2南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué),南京，211100

玫瑰痤瘡是一種慢性炎癥性皮膚病，世界范圍內(nèi)各國報(bào)道發(fā)病率不一，總體在2%～22%。其典型臨床表現(xiàn)為面中部陣發(fā)性潮紅、持久性紅斑、毛細(xì)血管擴(kuò)張、丘疹、膿皰、水腫、增生肥大等不同表型的組合，影響患者日常生活及社交[1]。目前認(rèn)為玫瑰痤瘡發(fā)病機(jī)制與遺傳、微生物感染、神經(jīng)血管失調(diào)、免疫系統(tǒng)失衡等有關(guān)。近來，越來越多研究著重于探討玫瑰痤瘡中的天然免疫，有研究發(fā)現(xiàn)玫瑰痤瘡皮損中存在大量天然免疫細(xì)胞浸潤，包括巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞[2]。其中不同研究提示玫瑰痤瘡皮損處巨噬細(xì)胞顯著增多，與玫瑰痤瘡炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[3-5]。芍藥苷(paeoniflorin，PF)是一種具有抗炎作用的中藥成分，其對于巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的作用提示其是否可能為玫瑰痤瘡潛在的治療藥物選擇。

本研究擬通過組織病理及免疫組化探討玫瑰痤瘡中巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥分子表達(dá)，并在細(xì)胞水平初步探討芍藥苷對于脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 組織、細(xì)胞及試劑 9例玫瑰痤瘡皮膚組織來源于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科經(jīng)臨床及組織學(xué)診斷為肉芽腫型玫瑰痤瘡患者皮膚活檢標(biāo)本。巨噬細(xì)胞為小鼠單核細(xì)胞系Raw 264.7細(xì)胞(ATCC號:TIB-71)。DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國ThermoFisher Scientific公司，10%胎牛血清購自美國Gibco公司；芍藥苷購自MCE公司；LPS購自sigma公司；CCK8試劑盒購自上海東仁化學(xué)科技有限公司；兔抗鼠SOCS3、p38、ASK1購自美國CST公司，兔抗鼠Tlr2、LL37、CD68、IL-1β購自美國Abcam公司，小鼠單抗β-actin購自Santa Cruz公司。HiScript II Select qRT SuperMix和SYBR Premix Ex TaqII購自南京諾唯贊生物科技有限公司。石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)購自武漢俊杰電子有限公司，倒置顯微鏡購自日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 組織病理學(xué)及免疫組化染色 皮膚組織標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片、脫蠟后行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)特征并采集圖像。另取空白切片采用CD68、SOCS3、LL37和IL-1β行免疫組化染色(1∶1000稀釋)，光學(xué)顯微鏡下采集圖片并分析皮損及非皮損區(qū)域陽性染色區(qū)域差異。

1.2.2 巨噬細(xì)胞及分組 將2×105Raw 264.7細(xì)胞在含10%胎牛血清無鈣DMEM培養(yǎng)基于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)70%時進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。將不同濃度(10-9～10-2mol/L)PF加入Raw 264.7細(xì)胞培養(yǎng)基后16 h檢測細(xì)胞增殖活性，篩選出不影響巨噬細(xì)胞增殖的合適PF實(shí)驗(yàn)濃度。此后Raw 264.7細(xì)胞分為三組，包括對照組、LPS誘導(dǎo)組(培養(yǎng)基中加入1μg/mL LPS，即為LPS組)以及干預(yù)誘導(dǎo)組(預(yù)先加入10-5mol/L PF培養(yǎng)4 h后，再加入1μg/mL LPS，即PF+LPS組)，繼續(xù)培養(yǎng)Raw 264.7細(xì)胞12h以上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測及增殖活性測定 在倒置顯微鏡下觀察對照組、LPS組以及PF+LPS組細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變并采集圖片。細(xì)胞增殖活性采用CCK-8試劑盒按說明進(jìn)行操作測定。

1.2.4 qRT-PCR檢測炎癥因子基因表達(dá) 引物序列如表1所示,具體采用△Ct 法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以Actin為內(nèi)參對照，計(jì)算三組Raw 264.7細(xì)胞中Camp、Tlr2和p38炎癥因子基因相對表達(dá)量。

1.2.5 Western Blot檢測炎癥因子蛋白表達(dá) 提取對照組、LPS組以及PF+LPS組Raw 264.7細(xì)胞蛋白后經(jīng)Western blot分別檢測SOCS3、p38、ASK1、Tlr2(1∶1000稀釋)蛋白表達(dá)，提取上清蛋白檢測LL37(1∶1000稀釋)蛋白表達(dá)，β-actin為對照。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 免疫組化圖像根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)×染色強(qiáng)度，進(jìn)行IRS評分分析[6]。Western Blot蛋白條帶采用imageJ軟件分析灰度，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料的兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差分析 (ANOVA)，所有分析均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 RAW細(xì)胞引物序列表

2 結(jié)果

2.1 玫瑰痤瘡組織標(biāo)本中巨噬細(xì)胞及炎癥因子 皮膚組織經(jīng)HE染色鏡下可見真皮內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤，多為淋巴細(xì)胞，另可見結(jié)節(jié)樣分布的上皮樣細(xì)胞肉芽腫(圖1)。CD68免疫組化染色可見皮損區(qū)大量棕色顆粒，較皮損周邊區(qū)域顯著增強(qiáng)，提示玫瑰痤瘡皮損區(qū)有大量巨噬細(xì)胞浸潤，另皮損區(qū)LL37、IL-1β和SOCS3表達(dá)較周邊增強(qiáng)，即提示玫瑰痤瘡皮損區(qū)域炎癥因子中LL37、IL-1β和SOCS3表達(dá)增高，且較周邊非皮損區(qū)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)。

圖1真皮內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤，多為淋巴細(xì)胞，另可見結(jié)節(jié)樣分布的上皮樣細(xì)胞肉芽腫(HE,×100)

2.2 PF對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化及合成炎癥因子的影響

2.2.1 無細(xì)胞毒性PF實(shí)驗(yàn)濃度的篩選 不同組Raw 264.7細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10-9～10-2mol/L 不同濃度PF后培養(yǎng)16 h檢測細(xì)胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)與10-2mol/L及10-3mol/L PF共同培養(yǎng)的Raw 264.7細(xì)胞增殖活性較空白對照組細(xì)胞顯著下降(P<0.05)，而不高于10-5mol/L PF則對Raw 264.7細(xì)胞增殖活性無顯著影響(圖3)。

圖2玫瑰痤瘡皮損組織免疫組化染色 a～c,d～f,g～i,j～k分別為CD68，LL37，IL-1β和SOCS3免疫組化染色及其對應(yīng)的陽性染色率IRS定量分析圖，N=9，*P<0.05(a,d,g,j:×100;b,e,h,k:×400)

2.2.2 PF對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的影響 倒置顯微鏡下正常Raw 264.7細(xì)胞呈大小均一的圓或類圓形，無明顯樹突狀反應(yīng)，LPS誘導(dǎo)后的Raw 264.7細(xì)胞則出現(xiàn)胞體增大，細(xì)胞周邊偽足伸出，細(xì)胞形狀變不規(guī)則而呈樹突狀改變。而LPS+PF組中Raw 264.7細(xì)胞鏡下可見樹突狀改變細(xì)胞比例較LPS組明顯減少，仍多呈圓或類圓形細(xì)胞(圖4)。

2.2.3 PF可抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞合成LL37 培養(yǎng)基中加入1μg/mL LPS的Raw 264.7細(xì)胞培養(yǎng)12 h后qRT-PCR結(jié)果提示LL37基因camp mRNA表達(dá)較對照組明顯增高，而10-5mol/L芍藥苷處理組Raw 264.7細(xì)胞加入LPS后LL37基因camp mRNA表達(dá)較對照組增高，較LPS組下降(P<0.05)。Western Blot檢測細(xì)胞上清液LL37蛋白結(jié)果趨勢與之類似(圖5)。

圖3不同濃度PF對Raw 264.7細(xì)胞增殖的影響(N=3，與對照組比，10-2mol/L及10-3mol/L PF預(yù)處理組細(xì)胞增殖存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，*P<0.05)

2.2.4 PF對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子的影響 培養(yǎng)基中加入1μg/mL LPS的Raw 264.7細(xì)胞培養(yǎng)12 h后qRT-PCR結(jié)果提示Tlr2和p38表達(dá)較對照組明顯增高，而PF預(yù)處理則可緩和這一改變，PF+LPS組Tlr2和p38基因表達(dá)較對照組增高，而較LPS組為低。Western Blot檢測對照組、LPS組和 PF+LPS組胞內(nèi)蛋白，結(jié)果趨勢與mRNA結(jié)果類似，LPS組Raw 264.7細(xì)胞ASK1、TLR2和p38表達(dá)增加，SOCS3表達(dá)降低，而PF的預(yù)處理則可緩和LPS誘導(dǎo)的炎癥因子改變，PF可抑制LPS誘導(dǎo)的Raw 264.7細(xì)胞的ASK1、TLR2和p38表達(dá)增加及SOCS3表達(dá)降低(P<0.05)，見圖6。

3 討論

玫瑰痤瘡是臨床常見慢性炎癥性皮膚病，依據(jù)典型表現(xiàn)，玫瑰痤瘡常分為四種臨床亞型，包括紅斑毛細(xì)血管擴(kuò)張型(erythematotelangiectatic rosacea，ETR)、丘疹膿皰型(papulopustular rosacea，PPR)、肥大增生型(phymatous rosacea，PhR)和眼型(ocular rosacea，OR)，但由于亞型間存在癥狀重疊并可相互轉(zhuǎn)化，故近年來逐步采用表型描述取代了臨床分型[7]。

玫瑰痤瘡具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚，可能是在一定遺傳背景基礎(chǔ)上，多因素誘導(dǎo)的以天然免疫和血管舒縮功能異常為主導(dǎo)的慢性炎癥性疾病。有文獻(xiàn)認(rèn)為玫瑰痤瘡與天然免疫細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞密切相關(guān)[2]，而其中巨噬細(xì)胞是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。

圖4不同組Raw 264.7細(xì)胞顯微鏡下形態(tài) a：對照組，×400；b：LPS組，×400；c：LPS+PF組，×400

圖5 PF可抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成camp基因和LL37蛋白(N=3，與對照組相比，*P<0.05，與LPS組相比，# P<0.05)

圖66a～6g：PF可抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成Tlr2和p38基因，并抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞ASK1、TLR2和p38表達(dá)增加及SOCS3表達(dá)降低(N=3，與對照組相比，*P<0.05；與LPS組相比，#P<0.05)

Buhl等[3]發(fā)現(xiàn)ETR、PPR及PhR三種臨床亞型的玫瑰痤瘡皮損中均存在顯著巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤。Smith等[5]同樣在20例玫瑰痤瘡皮損樣本中發(fā)現(xiàn)類似的顯著巨噬細(xì)胞局部浸潤，同時伴有血管內(nèi)皮細(xì)胞因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、VEGF受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)1和VEGFR2的高表達(dá)。Georgala等[4]研究有類似結(jié)果，并推測增多的巨噬細(xì)胞可能與局部毛囊蠕形螨過度增殖有關(guān)。近有研究證實(shí)在玫瑰痤瘡患者皮損及LL37誘導(dǎo)的玫瑰痤瘡樣小鼠模型皮損中解聚素金屬蛋白酶家族癸蛋白1(Disintegrin Metalloprotease ADAM-like Decysin-1，ADAMDEC1)均表達(dá)增高，且細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)ADAMDEC1可通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞經(jīng)典活化而參與玫瑰痤瘡炎癥反應(yīng)[8]。經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞可由LPS或Th1細(xì)胞因子等誘導(dǎo)，進(jìn)而分泌大量促炎因子和趨化因子包括白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、IL-12和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)而參與炎癥反應(yīng)[9]。這些結(jié)果均提示巨噬細(xì)胞的活化與玫瑰痤瘡炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，且抑制巨噬細(xì)胞經(jīng)典活化的分子或成分可能是治療玫瑰痤瘡的潛在藥物選擇。

人抗菌肽LL37是玫瑰痤瘡致病過程中的重要因子，皮內(nèi)注射LL37是誘導(dǎo)玫瑰痤瘡小鼠模型的經(jīng)典方法[10]。玫瑰痤瘡患者皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞高表達(dá)的TLR2可通過促進(jìn)KLK5的合成及活性，進(jìn)而使LL37表達(dá)上調(diào)[11]。Toll樣模式識別受體(Toll-like receptor，TLR)可表達(dá)于角質(zhì)形成細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面。TLR2識別皮表微生物如表皮葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌產(chǎn)物如LPS促發(fā)炎癥反應(yīng)，LL37、TNF-α、IL-1β等炎癥因子升高，進(jìn)而誘發(fā)玫瑰痤瘡相關(guān)的血管擴(kuò)張、增生及炎性皮疹表現(xiàn)。已有研究證實(shí)玫瑰痤瘡患者皮膚中TLR2和LL37表達(dá)明顯增高[2]。

我們實(shí)驗(yàn)中玫瑰痤瘡皮損組織病理提示皮損區(qū)顯著炎癥細(xì)胞浸潤，免疫組化結(jié)果提示巨噬細(xì)胞浸潤明顯，且炎癥因子LL37、IL-1β表達(dá)顯著增高，與此前文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果均相符合。

TLR2介導(dǎo)的p38和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)活化對于鏈球菌M1蛋白[12]、表皮葡萄球菌LP01脂肽[13]等刺激皮膚后產(chǎn)生的炎癥和抗菌反應(yīng)過程密切相關(guān)。p38蛋白激酶是細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)家族中控制炎癥反應(yīng)最重要的成員，可進(jìn)一步激活與炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子。Wladis等[14]發(fā)現(xiàn)眼型玫瑰痤瘡患者較正常健康人群眼瞼皮膚組織活化的p38和ERK表達(dá)增高。Yamasaki等[10]研究發(fā)現(xiàn)LL37可促進(jìn)玫瑰痤瘡皮膚炎癥反應(yīng)，而抑制p38則可選擇性抑制LL37所誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞合成IL-36γ[15]。細(xì)胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶 1(Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)是細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAP3Ks)家族成員之一?；钚匝?reactive oxygen species, ROS)可經(jīng)ASK1進(jìn)而激活p38誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)人β防御素(humanβ-defensins，hβD)1-3和LL37促進(jìn)炎癥反應(yīng)[16]。這些結(jié)果均提示TLR2、ASK1和p38在抗菌肽介導(dǎo)的玫瑰痤瘡皮膚炎癥中具有重要作用。

細(xì)胞因子信號抑制蛋白3(suppressor of cytokine signaling3, SOCS3)是一種常見的抑制性信號調(diào)節(jié)蛋白，參與負(fù)反饋調(diào)節(jié)MAPK等多條重要的信號通路。但多種細(xì)胞因子如IL-2、INF-γ、IL-6等可反饋性促進(jìn)SOCS3表達(dá)[17,18]。

PF是一種單萜類糖苷化合物，為白芍總苷的主要成分，具有一定抗炎和免疫抑制作用。在銀屑病模型小鼠中的研究[19]發(fā)現(xiàn)PF可減少銀屑病皮損中嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤，并進(jìn)而減少相關(guān)炎癥因子表達(dá)。我們的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PF的預(yù)處理可緩解LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞合成TLR2、ASK1、p38的增高和SOCS3的降低，提示PF可抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。而在玫瑰痤瘡組織病理中，我們研究發(fā)現(xiàn)玫瑰痤瘡皮損區(qū)較周邊區(qū)域SOCS3表達(dá)明顯增高，推測可能因玫瑰痤瘡皮損中多種炎癥因子增高反饋性促進(jìn)抑炎因子SOCS3表達(dá)有關(guān)。

我們的研究進(jìn)一步驗(yàn)證了玫瑰痤瘡皮損中存在大量巨噬細(xì)胞浸潤，且炎癥因子LL37、IL-1β和SOCS3表達(dá)增強(qiáng)，并在細(xì)胞學(xué)水平初步探討了PF對于LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)PF的抑制作用通過減緩TLR2、ASK1、p38表達(dá)增高和SOCS3表達(dá)降低而實(shí)現(xiàn)，但實(shí)驗(yàn)亦存在一定不足，如能在玫瑰痤瘡小鼠模型中進(jìn)一步驗(yàn)證我們的結(jié)果為最佳。

綜上所述，玫瑰痤瘡與巨噬細(xì)胞及炎癥因子密切相關(guān)。芍藥苷通過影響TLR2、SOCS3、ASK1和p38炎癥分子的表達(dá)可抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，可能是潛在治療玫瑰痤瘡的藥物選擇。