孔金玉，原 翔，劉怡文，孫 蔚，谷變利，蘭子君，高社干

腫瘤的發(fā)生發(fā)展常伴隨一系列遺傳和表觀遺傳的改變，受飲食、環(huán)境和微生物暴露以及宿主免疫等的影響。自幽門螺桿菌與胃癌的因果關(guān)系確定以來[1]，不同種類的細(xì)菌感染及其相應(yīng)的局部微生態(tài)的失衡與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系成為近年腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis, Pg)是一種革蘭氏陰性厭氧菌，是牙周病變主要的優(yōu)勢菌，是毒力最強(qiáng)的致病菌之一[2]。口腔頜面部靜脈瓣膜缺如，且血供豐富，致病菌可以輕易地隨血液循環(huán)至全身。已有研究證實(shí)Pg與口腔癌、胰腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3-4]。本團(tuán)隊(duì)前期研究顯示Pg與食管癌的發(fā)生發(fā)展有相互關(guān)聯(lián)性[5-6]。本研究旨在檢測Pg在口腔及消化道腫瘤中的感染情況，相關(guān)結(jié)果現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2012年1月至2018年12月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的口腔及食管鱗癌組織標(biāo)本各50例，賁門、胃癌各30例及結(jié)直腸癌35例。腫瘤標(biāo)本取自原發(fā)灶，取出后一部分置于液氮迅速冷凍，-80 ℃冰箱凍存待用，一部分經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋。所有患者均經(jīng)病理學(xué)確診為癌，且術(shù)前均未接受放化療及免疫治療，并于術(shù)前獲得患者書面知情同意。本項(xiàng)目經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會的同意。

1.2 主要試劑兔抗人Pg蛋白多克隆抗體獲贈于美國路易斯維爾大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，被用于檢測Pg感染；免疫組織化學(xué)SP超敏試劑盒、DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；檸檬酸抗原修復(fù)液(pH6.0)、蘇木精、中性樹膠購自索萊寶生物科技有限公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒購自諾唯贊公司；Pg上游引物：5’-AGGCAGCTTGCCATACTGCG3’及Pg下游引物5’-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’。

1.3 免疫組化癌組織經(jīng)10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成3 μm厚石蠟切片。切片經(jīng)0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液抗原高壓熱修復(fù)，采用免疫組織化學(xué)SP法，兔抗人Pg多克隆抗體濃度為1∶1 000，以0.01 mol·L-1的PBS(pH值7.5)代替一抗作為陰性對照，以組織中顯示棕黃色為Pg表達(dá)陽性。根據(jù)組織切片胞漿及胞核著色的強(qiáng)度和染色面積進(jìn)行綜合評分，在組織切片中，隨機(jī)挑選4個(gè)高倍鏡視野觀察(200倍)，染色強(qiáng)度：0分，未著色；1分，呈淺黃色；2分，呈棕黃色；3分，呈棕褐色；染色面積：陽性細(xì)胞所占比例0%～5%，0分；6%～25%，1分；25%～75%，2分；>75%，3分；免疫組化評分計(jì)算方法：染色強(qiáng)度乘以染色面積得總分，1～12分分別代表：0分，-，陰性；1～3分，++，弱陽性；4～8分，++，中陽性；9～12分，+++，強(qiáng)陽性。為方便統(tǒng)計(jì)，將“-”定為陰性，“+” “++”和“+++”定為陽性。

1.4 qPCR取凍存的癌組織樣本100 mg在液氮中研磨至粉末狀，加1 mL Trizol并按說明書提取總RNA，Nano-Drop 2000c(Thermo公司)微量紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度和純度，1%瓊脂凝膠電泳鑒定RNA完整性，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(Vazyme公司R222-01)，總反應(yīng)體系為20 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。根據(jù)Q-PCR試劑盒說明書(Vazyme公司 Q111-02)，每個(gè)PCR反應(yīng)體系為20 μL，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用BIO-RAD熒光定量PCR儀進(jìn)行定量檢測。反應(yīng)條件：95 ℃變性 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s(采集熒光)；40 個(gè)循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)分析免疫組化和qPCR兩種方法的一致性，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化法檢測Pg在口腔—消化道腫瘤組織中的感染情況應(yīng)用免疫組化法分別檢測口腔、食管鱗癌各50例，賁門、胃癌各30例及結(jié)直腸癌35例組織中Pg的陽性率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pg主要位于細(xì)胞質(zhì)，陽性染色呈棕黃色顆粒，見圖1。Pg在口腔、食管鱗癌組織中的陽性率分別為60.00%(30/50)和46.00%(23/50)；在賁門、胃、結(jié)直腸癌組織中的陽性率分別為20.00% (6/30)、6.67%(2/30)、2.86%(1/35)，見表1。

A、C、E、G、I分別為Pg染色陽性的口腔鱗癌、食管鱗癌、賁門癌、胃癌、結(jié)直腸癌組織；B、D、F、H、J分別為Pg染色陰性的口腔鱗癌、食管鱗癌、賁門癌、胃癌、結(jié)直腸癌組織。圖1 Pg在口腔—消化道腫瘤中的感染情況(DAB，×400)

2.2 qPCR法檢測Pg在口腔—消化道腫瘤組織中的感染情況應(yīng)用qPCR法分別檢測50例口腔鱗癌、50例食管鱗癌、30例賁門癌、30例胃癌及35例結(jié)直腸癌組織中Pg的陽性率。結(jié)果顯示Pg在口腔、食管鱗癌組織中的陽性率分別為56.00%(28/50)和42.00%(21/50)；Pg在賁門、胃、結(jié)直腸癌組織中的陽性率分別為16.67% (5/30)、3.33%(1/30)、2.86%(1/35)。Pg在口腔—消化道中的感染情況呈現(xiàn)上高下低的特點(diǎn)。

表1 Pg在口腔—消化道腫瘤中的感染情況 例(%)

2.3 兩種方法檢測Pg的一致性分析所有樣本應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析免疫組化和qPCR檢測Pg陽性率的一致性。結(jié)果顯示免疫組化與PCR法的結(jié)果具有一致性，一致率為91.8%，一致性系數(shù)Kappa為0.806，P<0.001，見表2。

表2 兩種方法檢測Pg的一致性分析

3 討論

Pg是寄居于口腔牙齦上皮細(xì)胞內(nèi)的一種革蘭氏陰性厭氧菌，作為口腔中的“紅色復(fù)合體”三大致病菌之一[7]，Pg已被證實(shí)是整個(gè)口腔微生態(tài)平衡的關(guān)鍵細(xì)菌。口腔特殊的解剖結(jié)構(gòu)與環(huán)境賦予Pg重要的病理生理學(xué)意義，廣泛的血源性侵入可促進(jìn)Pg參與全身系統(tǒng)性疾病進(jìn)程。新近研究發(fā)現(xiàn)，Pg可不間斷侵入感染大腦，破壞神經(jīng)元，是阿爾茲海默癥的高危險(xiǎn)因素[8]。近年來大量研究結(jié)果已表明，Pg抗體水平與冠狀動脈粥樣硬化、呼吸道感染及骨質(zhì)疏松等系統(tǒng)性疾病臨床風(fēng)險(xiǎn)皆呈正相關(guān)[2,9-10]。更為嚴(yán)峻的是，作為介導(dǎo)長期慢性感染而致癌的重要致病菌之一，Pg已被證實(shí)為頭頸部鱗癌重要病因之一[11-12]。

本研究結(jié)果顯示，Pg定植于口腔鱗癌組織中，感染率為56.00%，目前國內(nèi)外已有相關(guān)研究。2011年，Katz等[3]在一項(xiàng)分析報(bào)告中采用抗Pg (ATCC 33277)特異免疫組化法，比較了10例口腔鱗癌和5例健康受試者口腔組織樣本中Pg的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Pg在口腔鱗癌腫瘤組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常組織，作者同時(shí)選擇共生細(xì)菌，鏈球菌戈登作為參照，而后者未表現(xiàn)出任何表達(dá)差異。盡管此次研究的樣本量較小，卻首次確切報(bào)道了Pg感染與口腔鱗癌發(fā)生的顯著正相關(guān)性。自此，許多研究開始探索Pg參與致癌作用的機(jī)制[13]，盡管如此，Pg在口腔鱗癌發(fā)病中的作用仍不清楚，其潛在的機(jī)制待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)Pg在食管鱗癌、賁門及胃癌中的感染率分別為42.00%、16.67%、3.33%，與本團(tuán)隊(duì)之前研究報(bào)道一致[5]。本團(tuán)隊(duì)2016年在國際上首次發(fā)現(xiàn)Pg是食管癌的高危因素[6]，2017年研究證實(shí)Pg在食管癌和癌前病變組織中廣泛定植，癌旁及正常黏膜組織中則豐度較低，在賁門和胃癌中的含量很低或沒有，這種差異被歸因于Pg對pH酸性環(huán)境的低耐受性[5]。Salazar等[14]2013年在一項(xiàng)包含37例慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生或不典型增生的牙周炎患者的臨床研究中，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在上述患者的牙菌斑和唾液樣本中檢測了包括Pg在內(nèi)的幾種牙周致病菌的DNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，3種牙周致病菌，Pg、Td(Treponemadenticola)、Tf(Tannerellaforsythia)在牙菌斑中的定植，可增加胃癌癌前病變的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。以上報(bào)道均提示Pg可能以某種方式參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌組織中也存在Pg感染，感染率較低(2.86%)，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。2013年，Wu等[15]發(fā)表的病例對照研究報(bào)告中，采用16S rRNA基因焦磷酸測序檢測了19例結(jié)腸癌患者及20例健康受試者糞便微生物的變化，發(fā)現(xiàn)卟啉單胞菌屬在結(jié)腸癌患者的糞便樣本中遠(yuǎn)高于健康受試者。Hale等[16]的研究表明在結(jié)腸腺瘤患者糞便樣本中口腔菌屬的數(shù)量，包括放線菌屬、棒狀桿菌屬、嗜血桿菌屬、念珠菌屬和卟啉單胞菌屬明顯高于對照組。2017年，也有研究顯示在結(jié)直腸癌患者的糞便樣本中發(fā)現(xiàn)了更多的牙周病原體，如梭桿菌、顫螺旋菌屬、消化鏈球菌、卟啉單胞菌、羅斯氏菌和瘤胃球菌[17-18]。上述研究僅僅在結(jié)直腸癌患者的糞便中發(fā)現(xiàn)了卟啉單胞菌，并未在其癌組織中發(fā)現(xiàn)Pg，本研究首次發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中Pg的感染。

綜上所述，Pg在口腔癌中感染率最高，但在結(jié)直腸癌中感染率低至2.86%，提示Pg在口腔—消化道腫瘤中感染呈上高下低的分布規(guī)律，Pg可能通過口腔進(jìn)入食管及賁門組織，又由于胃酸的原因，在胃及結(jié)腸中幾乎消失。這些數(shù)據(jù)表明，根除口腔致病菌可能有助于口腔及食管、賁門癌的防治。