劉鐵峰 許澍妮 吳姍姍

慢加急性肝功能衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是慢性肝病患者由于急性肝功能失代償而出現(xiàn)的臨床癥候群，表現(xiàn)為黃疸、凝血障礙，并通常于4周內(nèi)出現(xiàn)腹水等癥[1]。在國(guó)內(nèi)，乙型肝炎病毒相關(guān)慢加急性肝功能衰竭(hepatitis B related acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)最為普遍[2]。HBV-ACLF病死率高，對(duì)其預(yù)后進(jìn)行準(zhǔn)確判斷，并于適當(dāng)時(shí)機(jī)行人工肝或肝移植治療，對(duì)降低病死率和合理利用醫(yī)療資源具有重要意義[3]。近期研究表明自噬在ACLF等肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4,5]。p62和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)為自噬相關(guān)蛋白，能反映機(jī)體自噬水平[6]，其對(duì)于判斷HBV-ACLF患者預(yù)后價(jià)值尚待明確。本研究對(duì)HBV-ACLF患者血清自噬相關(guān)蛋白(p62，LC3-Ⅱ)水平進(jìn)行測(cè)定，并探討二者聯(lián)合檢測(cè)在判斷HBV-ACLF患者近期預(yù)后中的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

一、一般資料

選取2016年9月至2018年9月在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院就診的78例HBV-ACLF患者，女性22例，男性56例，年齡21～68歲，平均(47.5±8.6)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《肝衰竭診治指南(2012年版)》[7]中ACLF診斷標(biāo)準(zhǔn)；②有乙型肝炎病史，HBsAg陽(yáng)性持續(xù)6個(gè)月以上；③研究經(jīng)院倫理委員會(huì)通過且患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他病毒感染者；②藥物性肝損傷或自身免疫性肝病者；③酒精性肝病或代謝性肝病者；④合并腎臟疾病及腎功能不全者。另選取同期健康體檢者42名作為對(duì)照組，其中女性13名，男性29名，年齡23～64歲，平均(46.5±8.3)歲，兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、方法

入院后抽取患者清晨空腹靜脈血，總膽紅素(TBil)和肌酐(Cr)使用全自動(dòng)生化分析儀(雅培CI8200)測(cè)定，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)使用自動(dòng)凝血儀(Sysmex CA-500)檢測(cè)；計(jì)算終末期肝病模型(model for end-stage liver disease，MELD)分值。血清p62和LC3-Ⅱ水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定，LC3-Ⅱ檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江萊生物科技有限公司，p62檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海雨朵生物科有限公司，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

記錄患者基線MELD分值及患者入院后3個(gè)月內(nèi)臨床結(jié)局，比較ACLF組和對(duì)照組入院時(shí)血清p62和LC3-Ⅱ水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、ACLF組與健康對(duì)照組血清p62和LC3-Ⅱ水平比較

ACLF組血清LC3-Ⅱ水平明顯高于對(duì)照組，p62水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。

表1 ACLF組與正常對(duì)照組血清p62和LC3-Ⅱ水平比較(±s)

二、血清p62和LC3-Ⅱ水平與MELD評(píng)分的相關(guān)性

ACLF組入院后MELD評(píng)分為(23.04±5.84)分，采用Pearson相關(guān)分析HBV-ACLF患者血清p62和LC3-Ⅱ水平與MELD評(píng)分相關(guān)性，結(jié)果顯示血清p62與MELD評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=0.383，P<0.05)；血清LC3-Ⅱ與MELD評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.458，P<0.05)。

三、血清p62和LC3-Ⅱ?qū)BV-ACLF患者近期預(yù)后的評(píng)估價(jià)值

觀察期間，78例HBV-ACLF患者中，38例死亡，占48.7%。生存組與死亡組HBV-ACLF患者血清p62，LC3-Ⅱ表達(dá)水平比較，結(jié)果死亡組血清LC3-Ⅱ表達(dá)水平顯著高于生存組，血清p62水平低于生存組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

表2 生存組與死亡組HBV-ACLF患者血清p62， LC3-Ⅱ表達(dá)水平比較(ng/mL，±s)

通過ROC曲線確定p62，LC3-Ⅱ預(yù)測(cè)的最佳臨界值，取約登指數(shù)最大時(shí)對(duì)應(yīng)的p62，LC3-Ⅱ水平作為臨界值，分別為1.51 ng/mL、80.74 ng/mL。血清p62、LC3-Ⅱ和二者聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC分別為0.727(95%CI：0.616～0.821)、0.736(95%CI：0.626～0.828)和0.813(95%CI：0.710～0.892)，二者聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC大于p62(Z=2.005，P=0.045)，LC3-Ⅱ(Z=2.005，P=0.046)單項(xiàng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，而p62與LC3-Ⅱ預(yù)測(cè)HBV-ACLF預(yù)后的AUC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.121，P=0.904)。見表3。

表3 血清p62、LC3-Ⅱ和二者聯(lián)合預(yù)測(cè)HBV-ACLF 患者近期預(yù)后的效力比較

討 論

HBV-ACLF是我國(guó)肝衰竭中最常見的亞型，患者可出現(xiàn)多器官功能衰竭和全身性炎癥反應(yīng)綜合征，臨床病死率高達(dá)50%[8]。研究發(fā)現(xiàn)，異常的信號(hào)通路調(diào)節(jié)及自噬在肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]。證據(jù)顯示，自噬在慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，并可能影響疾病的進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸[10]。生理水平的自噬在清除受損蛋白、細(xì)胞器，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面具有重要意義，而過高或過低的自噬水平則與疾病相關(guān)[11]。在慢性肝炎、肝硬化和肝衰竭中可出現(xiàn)自噬水平升高，而當(dāng)疾病進(jìn)展至肝癌時(shí)則表現(xiàn)為自噬水平降低[12]。LC3是與自噬相關(guān)的蛋白，包括兩種亞型，分別為L(zhǎng)C3-I和LC3-Ⅱ。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3-I脂質(zhì)化后形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ再與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合并定位在胞內(nèi)自噬體膜上[13]。因此，LC3-Ⅱ含量與自噬體數(shù)量呈正比，其可作為反映自噬起始階段的一種有效分子標(biāo)記物。自噬體是整個(gè)自噬動(dòng)態(tài)過程中的一個(gè)中間結(jié)構(gòu)，因此僅使用自噬體數(shù)量或LC3-Ⅱ含量來體現(xiàn)自噬活性的強(qiáng)弱不夠全面。自噬體形成后尚需與溶酶體融合才能執(zhí)行自噬降解功能。當(dāng)出現(xiàn)自噬體與溶酶體融合過程受阻時(shí)，自噬體降解減少，亦可導(dǎo)致自噬體數(shù)量增加。自噬降解底物p62蛋白是與LC3-Ⅱ和泛素化蛋白聚集體相關(guān)的銜接蛋白，其C端與泛素化蛋白綁定，通過N端與LC3-Ⅱ作用，并在自噬過程中整合入自噬吞噬體中，繼而在自噬溶酶體中降解，其表達(dá)量越高，則表明自噬功能越弱[14]。本研究結(jié)果顯示， HBV-ACLF患者LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平顯著高于健康人，p62蛋白表達(dá)水平低于健康人，提示HBV-ACLF患者的肝功能減弱和肝臟組織變化引起自噬水平被激活。

MELD評(píng)分是在終末期肝病預(yù)后評(píng)估中應(yīng)用最多的一種模型[15,16]。劉磊等[17]使用MELD評(píng)分對(duì)HBV-ACLF患者短期預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)其具有較好的預(yù)后評(píng)估價(jià)值。本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)血清p62與MELD評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，血清LC3-Ⅱ與MELD評(píng)分呈正相關(guān)，表明血清p62、LC3-Ⅱ水平與HBV-ACLF患者疾病預(yù)后有密切關(guān)聯(lián)。此外通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清p62、LC3-Ⅱ水平對(duì)HBV-ACLF患者近期預(yù)后具有較好的評(píng)估價(jià)值，且將二者聯(lián)合用于預(yù)測(cè)時(shí)，其預(yù)測(cè)能力明顯提升。

本研究檢測(cè)了78例HBV-ACLF患者入院時(shí)血清p62，LC3-Ⅱ水平，并分析了二者與HBV-ACLF患者近期預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示二者對(duì)HBV-ACLF患者近期預(yù)后有較好的評(píng)估價(jià)值，二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)預(yù)測(cè)效力明顯提升，