鞠曉紅，徐海月，李 強(qiáng)，陳 爽，方 芳 (吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

卵巢癌是常見(jiàn)的惡性生殖器腫瘤，極易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，初診時(shí)75%的患者已屬于晚期[1]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-esenchymal transition,EMT)是指上皮細(xì)胞在正常生理和特定病理情況下向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得間質(zhì)表型，使細(xì)胞獲得較高的遷移與侵襲能力[2]。目前，臨床針對(duì)卵巢癌的治療主要采用手術(shù)治療聯(lián)合鉑類化療作為治療手段，但是發(fā)生耐藥是卵巢癌治療失敗的重要因素[3]。因此，尋找有效治療卵巢癌的藥物至關(guān)重要。胡桃醌是從核桃楸中提純的一種天然成分，具有抗腫瘤的作用。前期研究結(jié)果表明，胡桃醌具有抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞黏附和侵襲作用[3]，是否胡桃醌具有抑制卵巢癌細(xì)胞EMT的作用還不清楚。本研究利用胡桃醌作用卵巢癌細(xì)胞，明確胡桃醌對(duì)卵巢癌細(xì)胞的EMT作用，并探討其作用機(jī)制，積極發(fā)現(xiàn)抑制卵巢癌細(xì)胞EMT的有效藥物，對(duì)于提高卵巢癌的療效十分重要。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人卵巢癌SKOV3細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；胡桃醌(美國(guó)Sigma公司)；兔抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、Snail、NF-κB p65、β-actin和Histon H抗體和NF-κB通路抑制劑PDTC(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma公司)；Western blotting系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)；生物顯微鏡(日本Olympus公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BioRad公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清IMDM培養(yǎng)液中，隔日換液，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移率

細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合率達(dá)80%左右時(shí)，用滅菌的200 μL槍頭垂直均勻地劃出1條筆直的無(wú)細(xì)胞的劃痕；PBS洗2次，然后根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的IC50值選擇加入20 μmol/L胡桃醌培養(yǎng)液[5]，以減少由于藥物引起的細(xì)胞凋亡造成對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照孔，顯微鏡下記錄位置并拍照，記該點(diǎn)為0 h。37 ℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h；取出6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，顯微鏡下原位點(diǎn)拍照，記該點(diǎn)為24 h。使用Image J軟件分析每個(gè)圖片無(wú)細(xì)胞區(qū)域面積，劃痕閉合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/(0 h劃痕面積)×100%，重復(fù)3次。

1.4 免疫印跡法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白及NF-κB-p65和Snail的表達(dá)

終濃度為20 μmol/L胡桃醌作用細(xì)胞24 h，加入細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮器刮取細(xì)胞，4 ℃超聲裂解細(xì)胞，分別提取細(xì)胞總蛋白和細(xì)胞核蛋白，收集上清液測(cè)蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下PVDF膜在封閉緩沖液中2 h，加兔抗E-cadherin、N-cadherin、NF-κB-p65、Snail抗體(1∶1000)、β-actin和Histon H抗體(1∶4000)4 ℃過(guò)夜。次日TBST洗膜，分別加HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶4000)，室溫避光孵育2 h。TBST洗膜，加底物發(fā)光顯影。使用Quantity One軟件掃描并做灰度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胡桃醌對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移率影響

與對(duì)照組劃痕閉合率(74.4±9.2)%比較，胡桃醌作用細(xì)胞后更少的細(xì)胞向劃痕中央聚集，劃痕閉合率為(40.6±4.7)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

陰性對(duì)照組 胡桃醌組

2.2 胡桃醌對(duì)SKOV3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)影響

結(jié)果顯示，對(duì)照組和20 μmol/L胡桃醌作用細(xì)胞24 h后E-cadherin表達(dá)分別是(0.31±0.04)和(0.45±0.05)；N-cadherin表達(dá)分別是(0.44±0.03)和(0.22±0.02)。與對(duì)照組比較，胡桃醌組的E-cadherin表達(dá)升高(P<0.05)、N-cadherin表達(dá)降低(P<0.01)。

陰性對(duì)照組 胡桃醌組

圖 2 胡桃醌對(duì)SKOV3細(xì)胞E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)影響

2.3 胡桃醌通過(guò)NK-κB途徑抑制SKOV3細(xì)胞EMT

Western blotting檢測(cè)陰性對(duì)照組和胡桃醌組細(xì)胞NK-κB p65和Snail的表達(dá)。結(jié)果表明，陰性對(duì)照組的NF-κB p65和Snail的表達(dá)分別是(0.84±0.04)和(0.43±0.03)；胡桃醌組NF-κB p65和Snail的表達(dá)分別是(0.57±0.02)和(0.21±0.03)。與陰性對(duì)照組比較，胡桃醌組的NF-κB p65和Snail的表達(dá)下降(P<0.05，P<0.01)(圖3)。表明胡桃醌可能通過(guò)NF-κB信號(hào)途徑抑制SKOV3細(xì)胞的EMT作用。

為了進(jìn)一步證實(shí)NF-κB信號(hào)通路參與胡桃醌抑制SKOV3細(xì)胞的EMT作用，NF-κB途徑抑制劑吡咯二硫氨基甲酸酯10 μmol/L(PDTC)與胡桃醌作用，Western blotting檢測(cè)Sanil的表達(dá)。結(jié)果顯示，與胡桃醌組Snail蛋白表達(dá)(0.62±0.02)比較，胡桃醌與PDTC聯(lián)合作用細(xì)胞后Snail蛋白表達(dá)(0.1±0.01)下降(P<0.01)(圖4)。

陰性對(duì)照組 胡桃醌組

圖 3 胡桃醌對(duì)SKOV3細(xì)胞NF-κB p65和Snail蛋白表達(dá)影響

圖 4 PDTC促進(jìn)胡桃醌抑制Snail蛋白表達(dá)

3 討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移是復(fù)雜過(guò)程。其中，腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)病灶并獲得侵襲能力是腫瘤轉(zhuǎn)移的第一環(huán)節(jié)。EMT是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。間質(zhì)表型能增加細(xì)胞遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力。EMT的發(fā)生伴隨上皮標(biāo)志物E-cadherin、緊密連接蛋白ZO-1、β-連環(huán)素等表達(dá)下調(diào)；間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白、N-cadherin等表達(dá)上調(diào)。其中E-cadherin的表達(dá)下降在EMT的發(fā)生中至關(guān)重要[6]。胡桃醌是從核桃楸中提純的一種天然成分，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的功能[7-8]。本研究結(jié)果表明，胡桃醌作用卵巢癌SKOV3細(xì)胞可以抑制細(xì)胞遷移、使E-cadherin表達(dá)升高而N-cadherin表達(dá)下降的作用,表明胡桃醌具有抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞EMT的作用。

EMT的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，多種生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路參與EMT的調(diào)節(jié)，其中Snail是重要調(diào)節(jié)EMT的轉(zhuǎn)錄因子。Snail可以結(jié)合到E-cadherin基因的啟動(dòng)子近端部位的E-box序列，進(jìn)而抑制其表達(dá)水平，從而導(dǎo)致EMT現(xiàn)象的發(fā)生[9]。NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子與腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等多個(gè)過(guò)程密切相關(guān)。P65是NF-κB一個(gè)亞基，其激活后由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制凋亡等作用[10]。NF-κB信號(hào)通路是卵巢癌細(xì)胞促進(jìn)化療耐藥、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和免疫逃逸的主要掌控者[11]。Snail作為重要的EMT轉(zhuǎn)錄因子可以被NF-κB調(diào)節(jié)。NF-κB可以作用在Snail的啟動(dòng)子區(qū)增加Snail的轉(zhuǎn)錄[12]。本研究結(jié)果表明，胡桃醌能夠抑制SKOV3細(xì)胞NF-κB p65和Snail表達(dá)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證胡桃醌通過(guò)NF-κB途徑抑制卵巢癌細(xì)胞EMT的作用，研究使用了NF-κB途徑激活劑PDTC處理SKOV3細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDTC能夠進(jìn)一步抑制Snail蛋白的表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌可能通過(guò)抑制NF-κB/Snail信號(hào)通路降低卵巢癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，從而減少卵巢癌細(xì)胞侵襲。本研究明確胡桃醌抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用，為卵巢癌的臨床研究和治療提供一定的理論基礎(chǔ)。