張 赫,楊 檸,李家富,吳 迪,佟 月,沈 楠,張美超
(吉林醫(yī)藥學院:1.臨床醫(yī)學院,2.醫(yī)學實驗中心,吉林 吉林 132013)
非酒精性脂肪性肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是由除乙醇等其他明確損傷肝因素引起的,以肝細胞彌漫性脂肪變性為主的臨床病理綜合征。其病變過程是由非酒精性單純性脂肪肝依次進展為非酒精性脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬化,最終進展成肝細胞癌而死亡[1]。黑木耳多糖有D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、D-葡萄糖及葡萄糖醛酸等多種重要成分,具有調節(jié)免疫力、抗血栓、抗氧化、調節(jié)血脂、降低動脈粥樣硬化、降血糖等多種藥理活性[2]。因此,本研究探討黑木耳多糖對NAFLD大鼠脂代謝的影響,為黑木耳多糖調節(jié)脂代謝、改善肝脂肪變提供理論參考依據。
黑木耳多糖(西安天瑞生物);洛伐他汀(鄭州創(chuàng)美生物科技有限公司);脫氧膽酸鈉(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司);膽固醇(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司);1,2-丙二醇(天津市大茂化學試劑廠);玉米油(長春市富民達榨油機械有限公司);奶粉(大慶乳品廠有限責任公司);蔗糖(天津市瑞金特化學品有限公司);總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。
PT-3502B酶標分析儀(北京普天新橋技術有限公司);電熱恒溫干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠);全自動生化分析儀(德國貝克曼公司),普通高速離心機(德國Eppendorf);722分光光度計(上海分析儀器廠);PT-3502B酶標分析儀(北京普天新橋技術有限公司);電熱恒溫干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠);普通高速離心機(德國Eppendorf);數顯恒溫水浴鍋(金壇市江南儀器廠)。
依據參考文獻加以調整[3],分為水相和油相。水相:向燒杯里依次加入蒸餾水、蔗糖、脫氧膽酸鈉及奶粉并攪拌均勻;油相:將先將1,2-丙二醇和玉米油倒入燒杯,將燒杯放入80 ℃恒溫水浴箱內,再慢慢加入膽固醇,并用玻璃棒不停攪拌。最后將水相倒入油相,充分攪拌,即可得到脂肪乳膠。
Wistar雄性大鼠,體重為200~250 g(哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心提供),適應性喂養(yǎng)7 d后開始進行實驗。隨機選取60只健康雄性大鼠適應性飼養(yǎng)1周,隨機分為6組,分別為空白對照組,模型對照組,黑木耳多糖低、中、高劑量組(50、100、200 mg/kg)及洛伐他汀組(7.48 mg/kg)。除空白對照組外,其他組每日灌胃1次高脂乳劑(1 mL/100 g)。10 h后,給藥組按1 mL/100 g分別灌胃相應藥物,空白對照組及模型對照組灌胃同等體積的生理鹽水,連續(xù)進行6周實驗。
實驗結束前禁食不禁水8 h,稱重大鼠,采用10%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠,腹主動脈取血。一部分全血裝入真空采血管,送檢驗科測載脂蛋白;另一部分裝于離心管中,以2500 r/min離心15 min,分離獲取適量血清,嚴格按照試劑盒規(guī)定檢測并記錄TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量。
分別取各組大鼠肝左葉相同部位、大小的肝組織,使用冰生理鹽水洗凈肝表面血跡,中性甲醛固定肝組織,石蠟包埋,常規(guī)切片及HE染色,光鏡下觀察各組大鼠肝組織的病變情況。
與空白對照組相比,模型對照組大鼠肝濕重、肝指數均升高,其中肝濕重具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組相比,洛伐他汀組大鼠肝濕重、肝指數均下降(P<0.01);黑木耳多糖低、中、高劑量組大鼠肝濕重、肝指數均降低,其中,黑木耳多糖低、高劑量組肝濕重具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),黑木耳多糖中、高劑量組肝指數具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),且肝指數呈劑量依賴性下降,如表1所示。
表 1 黑木耳多糖對大鼠肝濕重、肝指數的比較
與對照組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.01
如圖1所示,空白對照組肝小葉結構完整,肝細胞形態(tài)正常;模型對照組肝小葉不完整,肝細胞可見明顯的脂肪變,甚至見肝細胞壞死;洛伐他汀組肝小葉結構基本恢復正常,偶見肝細胞脂肪變;黑木耳多糖低、中、高劑量組肝小葉較為完整,偶見肝細胞脂肪變,組間變化不明顯。
與空白對照組比較,模型對照組apoA1水平降低(P<0.01),apoB水平升高(P<0.01);與模型對照組比較,洛伐他汀組apoA1、apoB水平均降低(P<0.01);黑木耳多糖中劑量組apoA1水平降低(P<0.01),黑木耳多糖低、中、高劑量組apoB水平均降低,如表2所示。
A:空白對照組;B:模型對照組;C:洛伐他汀組;D:黑木耳多糖低劑量組;E:黑木耳多糖中劑量組;F:黑木耳多糖高劑量組
圖 1 黑木耳多糖對大鼠肝臟的影響
表 2 黑木耳多糖對大鼠載脂蛋白的影響
與對照組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.01
與空白對照組對比,模型對照組血清TG、TC含量均升高(P<0.01),LDL-C含量亦升高,HDL-C含量下降。與模型對照組對比,洛伐他汀組TG、TC含量均下降(P<0.05),LDL-C、HDL-C含量均升高;黑木耳多糖低、中、高劑量組TG、TC含量均下降(P<0.01),LDL-C水平下降,HDL-C組呈波動性改變,如表3所示。
以往認為,肥胖是NAFLD病最常見的危險因素之一,且與脂肪肝形成最為密切。新近研究表明,并非肥胖程度越高越易誘發(fā)脂肪肝,體重指數正常的人群也可發(fā)生脂肪肝。與皮下脂肪性肥胖相比,內臟脂肪性肥胖與脂肪肝的形成密切相關。而肝指數是反映內臟脂肪性肥胖與脂肪肝關系的主要檢測指標,與內臟脂肪性肥胖呈正相關。本研究發(fā)現:模型對照組大鼠肝指數較正常組明顯升高,提示肝指數一定程度反映了肝脂肪變。洛伐他汀治療有效。黑木耳多糖低、中、高劑量藥物干預后,大鼠肝指數較模型組明顯下降,且具有劑量依賴性,尤其中、高劑量組恢復肝指數程度相對明顯。大鼠肝臟組織HE染色結果與此相似,黑木耳多糖低、中、高劑量組均具有明顯的降低肝細胞脂肪變性程度的作用。結果表明黑木耳多糖具有改善肝細胞脂肪變性的藥理作用。
表 3 黑木耳多糖對大鼠血脂的影響
與對照組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.01
肝脂肪變是多種原因引起的肝細胞內脂質含量增多,特別是TG的堆積[4]。TC、TG、LDL-C的升高會促進脂肪肝的發(fā)展,HDL-C則會把動脈壁上及周圍組織的膽固醇帶到肝內代謝,阻止脂質在動脈壁和肝內積累,抑制脂肪肝的形成[5]。因此,脂代謝與TC、TG、LDL-C、HDL-C含量密切相關。本研究發(fā)現,洛伐他汀可使TG、TC水平下降,LDL-C、HDL-C水平升高;而黑木耳多糖低、中、高劑量組具有明顯的降TG、TC水平,但降LDL-C作用不明顯,而HDL-C呈波動性改變。這說明,黑木耳多糖的確可起到降血脂的目的,但其作用機制可能與洛伐他汀不同。
甘油三酯和膽固醇等的合成與分解主要在肝細胞中,線粒體為脂肪酸分解代謝β-氧化的主要場所,機體主要通過LDL-C受體途徑和單核-吞噬細胞系統(tǒng)清除LDL-C等產物。但是,迄今為止,脂代謝異常的機制不明確。載脂蛋白在脂代謝過程中發(fā)揮著非常重要的作用。apoA1是肝臟產生HDL-C所需的載脂蛋白[6],逆轉TC至肝臟也是經過apoA1實現的。apoB是肝臟產生LDL-C過程中所用的主要載脂蛋白,促進LDL-C將TC運送至外周血液。細胞膜上的LDL-C受體也可以經過apoB識別LDL-C并將LDL-C轉入細胞內,所以apoB可以間接反映LDL-C水平[7]。本次研究發(fā)現:陽性藥可降低apoA1、apoB的水平,而黑木耳多糖只有中劑量組表現出明顯地抑制apoA1、apoB的水平[8]。以上說明,黑木耳多糖有部分通過載脂蛋白調控血脂代謝的作用。
總之,黑木耳多糖能改善脂肪變實驗大鼠的一般狀態(tài),減輕肝內脂質沉積,改善肝脂肪變性程度,具有保護肝臟、調節(jié)血脂的作用,為NAFLD的干預及治療提供新的理論依據。然而,黑木耳多糖對NAFLD大鼠血脂起效途徑的具體機制仍需要進一步深入研究。