宋佳堉，叢夢雨，巫柳岑，王術(shù)玲

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

廣東地處嶺南，氣候炎熱濕溫，四季長夏冬暖，吳又可《溫疫論》 中曾道：“南方卑濕之地，更遇久雨淋漓，時有感濕者?！鼻宕鷱V東名醫(yī)何夢瑤于《醫(yī)碥·中濕》道：“嶺南地卑土薄，土薄則陽氣易泄，人居其地，腠理汗出，氣多上壅。地卑則潮濕特盛，晨夕昏霧，春夏淫雨，人多中濕……?！睅X南地區(qū)人們喜澡善泳，喜食生猛海鮮，長期濕悶的氣候和當(dāng)?shù)氐纳铒嬍沉?xí)俗影響著人們的脾胃運化功能[1-2]。濕邪綿綿久客體內(nèi)，易困脾胃，遂成濕證體[3-4]。尤其每年三、四月份陰雨綿綿，濕證癥狀最為明顯，起床難，沒精神，身困體乏，納呆，四肢酸沉，大便粘滯不成形，舌苔白厚、黃膩、邊有齒痕[5]。廣東人習(xí)用具有祛濕、健脾、降火、清熱等功效的中藥煲湯或煮涼茶以緩解癥狀，調(diào)理濕證體質(zhì)，比如葛根鯽魚湯、木棉花糖水等。根據(jù)中醫(yī)理論，濕證病因重在脾胃，胃腸道功能是濕證的主要病機[6]，大便溏薄或瀉泄是濕證體質(zhì)的重要表現(xiàn)，而大便形狀與腸道菌有直接關(guān)系，因此推測濕證體質(zhì)人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)可能存在一定的破壞[7]，故本文通過招募志愿者，利用16S rRNA擴增子測序[8-9]，研究濕證體質(zhì)人群的腸道菌群組成。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究采用問卷調(diào)查的方式，于2018年3月—2018年4月召集志愿者53名，性別不限，年齡19～25歲，BMI 19～26 kg/m2。志愿者經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)黎同明、高潔兩位教授的診斷并結(jié)合調(diào)查問卷的內(nèi)容，分成健康對照組和濕證組。濕證人群的納入標準：主證為大便溏而不爽，身重肢倦[1,10]。正常對照組應(yīng)無上述癥狀及其他任何不適。排除標準：近3個月內(nèi)使用過抗生素；近1個月內(nèi)服用過益生菌制劑(包括酸奶)；患有消化道疾病。經(jīng)過診斷，符合標準者共29名，濕證組(簡稱M組)16名和正常組(簡稱C組)13名。本研究符合世界衛(wèi)生組織《涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究國際倫理準則》和世界醫(yī)學(xué)協(xié)會最新修訂的《赫爾辛基宣言》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 糞便樣本的收集

志愿者按日常習(xí)慣排便后，立刻收集于冷凍保藏管中，置于醫(yī)用冰盒運回實驗室，放入-80℃冰箱待制樣送檢。收回樣本29個，其中編號為C7、C9、M4、M8、M9、M11、M13的志愿者采樣時操作不規(guī)范，故棄去，共剩余有效樣本22個。

1.3 樣品檢測與庫的建立

提取糞便樣本總DNA，使用Qubit法對樣品濃度進行精確定量檢測，合格后需建立文庫，構(gòu)建目的擴增子(Amplicon)片段并回收。使用融合引物建庫方法，合成融合了目標序列引物和上機接頭、index等序列的引物，通過一步PCR擴增直接完成建庫，使用Agencourt AMPure XP磁珠進行純化并溶于Elution Buffer。樣品的合格檢測，總DNA提取質(zhì)控，修飾末端融合引物并PCR擴增，測序文庫構(gòu)建及 Illumina Miseq 平臺高通量測序由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Illumina Miseq平臺對腸道菌群DNA進行高通量測序；上機數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，濾除低質(zhì)量的reads，剩余高質(zhì)量的Clean data方可用于后期分析；通過reads之間的Overlap關(guān)系將reads拼接成Tags；在給定的相似度下將Tags聚成OTU，然后通過OTU與數(shù)據(jù)庫比對，對OTU進行物種注釋；基于OTU和物種注釋結(jié)果進行樣品物種復(fù)雜度分析以及組間物種差異分析。通過Alpha Diversity(α多樣性分析)，Beta Diversity(β多樣性分析)，等數(shù)據(jù)分析手段，最終得到糞便菌群的物種豐度信息。

2 結(jié)果

2.1 樣本測序數(shù)據(jù)分析

本項目入選的研究樣本共22個，其中對照組(Control)和濕證組各11個樣本。高通量焦磷酸測序共產(chǎn)生1 374 547條有效序列，其中對照組11個樣本獲得688 061條有效序列(平均每個樣品序列數(shù)為62 551±421)；11個濕證組樣本共獲得686 486條有效序列(平均每個樣品序列數(shù)為62 408±396)。[11]通過分析不同樣本OTU組成(97%相似性),可以反映樣本的差異和距離。如果兩個樣品距離越近，則表示這兩個樣品的組成越相似、差異越小。不同處理或不同環(huán)境間的樣本可能表現(xiàn)出分散和聚集的分布情況，從而可以判斷相同條件的樣本組成是否具有相似性。圖1為基于OTU豐度的PLS-DA 分析，可看出濕證組和對照組的組成差異較大。

圖1 基于OTU豐度的PLS-DA 分析圖

2.2 腸道微生物 α多樣性分析——微生物群落結(jié)構(gòu)分析

利用獨立樣本t檢驗(雙側(cè))對所有樣本有效序列的群落豐富度指數(shù)(species richness)和群落多樣性指數(shù)(species diversity)進行比較分析[12]，包括：Observed species、ace、 Chao、Shannon和Simpson等5個指數(shù)。如表1所示，反映群落豐富度的Observed species，ace和Chao指數(shù)在濕證組顯著性高于對照組(P<0.05)；而反映群落多樣性的Shannon和Simpson指數(shù)在濕證組與對照組相比無差異。以上結(jié)果提示，濕證組比正常對照組的腸道菌群群落豐富度發(fā)生了顯著變化。

表1 濕證組和健康對照組α多樣性參數(shù)比較

注：*P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義

2.3 腸道微生物 β 多樣性分析

β多樣性分析(β diversity)是用來比較物種多樣性方面存在的差異大小，本文采用unweighted UniFrac指數(shù)衡量β多樣性，利用該指數(shù)得到的分析圖中距離越大表示樣本間的差異越大。如圖2中的主坐標分析PCoA圖所示，除個別樣本存在偏差，濕證組和健康對照組基本呈現(xiàn)在不同區(qū)域。

圖2 β多樣性分析(物種多樣性)

2.4 門水平腸道菌群序列分類分析

腸道菌群大多數(shù)序列隸屬于Firmicutes(厚壁菌門)及Bacteroidetes(擬桿菌門)，這兩種菌門序列大約占總序列數(shù)90%以上，是腸道菌群中的絕對優(yōu)勢菌群。本研究中，在門水平上，濕證組與健康對照組之間，腸道菌群物種豐度較高的擬桿菌門(Bacteroidetes，49.94% vs 45.09%)、厚壁菌門(Firmicutes，42.16% vs 45.75%)、變形菌門(Proteobacteria，6.87% vs 6.76%)、藍藻菌門(Cyanobacteria，0.12% vs 0.05%)、軟壁菌門(Tenericutes，0.04% vs 0.02%)、放線菌門(Actinobacteria，0.70% vs 1.10%)均未見顯著性差異。而與對照組相比，差異最明顯的是梭桿菌門(Fusobacteria，0.12% vs 0.89%) 濕證組降低了86.5%(P<0.05)。見圖3。

圖3 門水平物種差異圖

2.5 科水平腸道菌群物種組成分類分析

在科水平上，與對照組相比，差異最明顯的是普雷沃菌科(Paraprevotellaceae，2.08% vs 0.03%)，濕證組升高了近70倍(P<0.05)；此外，韋榮球菌科(Erysipelotrichaceae，0.25% vs 0.95%)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae，0.56% vs 1.04%)，濕證組分別下降了73.95%、46.34%(P<0.05)。見圖4。

2.6 屬水平腸道菌群物種組成分類分析

濕證組與對照組相比共有6個屬差異顯著，分別是梭桿菌屬(Fusobacterium，0.07% vs 1.13 %)，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium，0.56 % vs 1.04 %)，濕證組分別降低了93.76%、46.40%(P<0.05)；薩特氏菌屬(Sutterella，1.39% vs 0.82%)，顫螺旋菌屬(Oscillospira，1.01 % vs 0.64 %)，糞球菌屬(Coprococcus，1.93% vs 0.70 %)，丁酸亞胺菌屬(Butyricimonas，0.22% vs 0.07%)，濕證組分別升高了69.08%、58.19%、176.59%、200.78%(P<0.05)。見圖5。

圖4 科水平物種差異圖

圖5 屬水平物種差異圖

2.7 種水平上腸道菌群組成分析

與對照組相比，濕證組中的產(chǎn)蛋白酶嗜熱細菌(Anoxybacillus kestanbolensis)豐度顯著降低(P<0.05)；而口腔毛絨厭氧桿菌菌(Lachnoanaerobaculum orale)、嬰兒鏈球菌菌(Streptococcus infantis)、瘤胃乳桿菌(Lactobacillus ruminis)、產(chǎn)黑普氏菌(Prevotella melaninogenica)、淡黃奈瑟氏菌(Neisseria subflava)、牙髓卟啉單胞菌(Porphyromonas endodontalis)、粘滑羅氏菌(Rothia mucilaginosa)、齡齒羅氏菌(Rothia dentocariosa)在濕證組的豐度顯著升高(P<0.05)。見圖6。

圖6 種水平物種差異圖

2.8 PICRUSt腸道菌群功能預(yù)測分析

利用PICRUSt軟件對16S測序樣本中可能存在的各級KEGG通路及豐度值進行預(yù)測，共富集到81個功能通路[13]，其中濕證組有9條通路相對于正常對照組差異顯著(P<0.05)，見圖7，分別是：半胱氨酸和甲硫氨酸代謝(cysteine and mathionine metabolism)，能量代謝(energy metabolism)，葉酸生物合成(folate biosynthesis)，半乳糖代謝(galactose metabolism)，甘油磷脂代謝(glycerophospholipid metabolism)，脂多糖生物合成蛋白(lipopolysaccharide biosynthesis proteins)，氮代謝(nitrogen metabolism)，氧化磷酸化作用(oxidative phosphorylation)，五磷酸途徑(pentose phosphate pathway)。說明濕證體質(zhì)引起的各種不適(如大便不爽，四肢酸沉等)可能與這些通路的功能異常有關(guān)。

圖7 差異通路圖

3 討論

本文對比了濕證體質(zhì)志愿者與健康對照志愿者的腸道菌群組成，發(fā)現(xiàn)整體指標上，濕證組的群落豐富度指數(shù)與健康對照組顯著不同，而群落多樣性指數(shù)沒有差異，提示濕證組的腸道菌群中沒有形成新的菌種，只是有些細菌分布比例發(fā)生顯著改變。具體表現(xiàn)為濕證組的梭桿菌門(Fusobacteria)、韋榮球菌科(Erysipelotrichaceae)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)顯著降低，普雷沃菌科(Paraprevotellaceae)顯著升高；另外，還發(fā)現(xiàn)濕證組有6個屬、9個種的細菌分布與健康對照組顯著不同。此外我們利用PICRUSt軟件預(yù)測到這些腸道菌群的改變能引起11個通路的功能改變，提示這些功能的改變可能是濕質(zhì)體質(zhì)癥狀表現(xiàn)的誘因。

老火靚湯和涼茶是廣東最有特色的兩張名片，是千百年來人類與大自然抗 爭的結(jié)果，利用一些藥食同源的中藥材調(diào)理人體以適應(yīng)環(huán)境、氣候等對健康的影響。歷來中醫(yī)古籍記載嶺南多疫瘴癘氣，這與濕溫的氣候?qū)е驴諝庵形⑸锓植枷啾缺狈揭嘤嘘P(guān)[14]。嶺南濕熱蘊蒸的氣候特點使長久生活于此的居民容易形成濕證體質(zhì)，最常見的表現(xiàn)之一就是大便粘滯不爽，本文通過對濕證體質(zhì)人群的腸道菌進行基因測序，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，濕證組的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。而廣東人習(xí)用的煲湯藥材或凉茶或許是通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)而改善濕證的癥狀[15]，這些推測仍需更深入的研究。