田冰，來杰，黃樹明*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省藥品檢驗研究中心，黑龍江 哈爾濱 150088)

慢性低灌注腦損傷(chronic cerebral hypoperfusion, CCH)又稱慢性腦缺血，是由于長期腦血流量灌注不足所致。大量研究表明[1]，慢性低灌注腦損傷可導(dǎo)致臨床認(rèn)知障礙和血管性癡呆的發(fā)展。對大鼠采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎(bilateral common carotid artery occlusion, BCCAO)可有效模擬腦慢性低灌注損傷[2]。

中藥延胡索，又名元胡、延胡等，為罌粟科(Papaveraceae)紫堇屬植物延胡索(CorydalisyanhusuoW. T. Wang ex Z. Y. Su et C. Y. Wu)的干燥塊莖，具有活血，止痛，行氣之功。延胡索的主要活性成分為生物堿類，包括叔胺型和季胺型生物堿，和大量非生物堿類成分。目前，從塊莖中分離鑒定的生物堿已有60余種，如延胡索甲素(d-Corydaline)、延胡索乙素(tetrahydropalmatine, THP)、左旋延胡索乙素(levo-tetrahydropalmatine，l-THP)、脫氫紫堇堿(dehydrocorydaline，DHC)、四氫小檗堿(tetrahydroberberine, THB)和四氫黃連堿(tetrahydrocoptisine)等[3]。現(xiàn)代基礎(chǔ)研究表明：延胡索具有擴(kuò)張冠脈血管、提高冠脈血流量的作用[4]，可預(yù)防大鼠急性全腦缺血再灌注損傷[5]，抑制腦缺血再灌注組織中Ca2+聚集，明顯減輕大鼠神經(jīng)功能障礙并減輕由于缺血再灌注腦組織的病理損害[6]。延胡索總生物堿(TAC)是從延胡索塊莖中提取純化的總生物堿有效部位，純度達(dá)80%以上?，F(xiàn)代研究表明，中藥的多組分特性對腦血管作用具有多靶點(diǎn)性和疊加性的特點(diǎn)[7]，對中藥有效部位的提取也有利于實際應(yīng)用。本研究以永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈法制備大鼠模型，探討TAC對慢性低灌注腦缺血的保護(hù)作用，為新藥研發(fā)和臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級Wistar大鼠60只，雄性，體質(zhì)量(220±20)g購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評價中心，合格證編號：SCXK(黑)2013-0004。飼養(yǎng)條件：溫度(22±2)℃，濕度45%～60%，動物分籠飼養(yǎng)，12 h/d循環(huán)光照。

1.2 藥品及試劑

TAC(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗實訓(xùn)中心提供，純度達(dá)85%)；尼莫地平(三精明水藥業(yè)有限公司，批號：1805002)；10%水合氯醛(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，批號：20181219)；伊紅染液(北京索萊寶科技有限公司，批號：20181112)；蘇木素染液(北京索萊寶科技有限公司，批號：20181025)；兔抗大鼠VEGF抗體(博士德生物工程有限公司，批號:13CM409B)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：K196721D)；聚合HRP標(biāo)記抗兔Ig G試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：A108168211)；石蠟(LEICA，批號：39601095)；手術(shù)器械(3-0手術(shù)線、手術(shù)剪、止血鉗等)；中性樹膠、多聚甲醛、二甲苯、無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 儀器

JR-30鼠恒溫實驗臺(成都泰盟軟件有限公司)；走橫木裝置(自制)；Morris水迷宮裝置及視頻分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；光學(xué)顯微鏡(LEICA，型號：DM2500)；微量分析天平(瑞士Mettler Toledo公司，型號：XS205DU)；自動組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、漂片儀、烘片機(jī)(LEICA)。

2 方法

2.1 實驗分組及BCCAO模型制備

取Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(Sham組)、模型組(Model組)、TAC組和陽性對照組(Nimodipine組)。大鼠于手術(shù)前禁食12 h，禁水3 h。使用10%水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，將大鼠仰臥位固定，于頸部正中切口，鈍性分離肌肉組織和筋膜，輕柔分離頸動脈鞘和迷走神經(jīng)，暴露雙側(cè)頸總動脈，采用3-0#手術(shù)線永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，縫合皮膚。Sham組僅分離雙側(cè)頸總動脈，不進(jìn)行永久性結(jié)扎。

2.2 給藥方案

于造模4周后給藥，TAC組灌胃給予TAC 7.0 mg/kg，1次/d；Sham組和Model組灌胃給予等體積的純化水，Nimodipine組灌胃給予尼莫地平10.8 mg/kg，灌胃體積10 mL/kg，連續(xù)給藥4周。

2.3 精細(xì)運(yùn)動能力檢測

走平衡木實驗(balance beam test,BBT)是評價大鼠精細(xì)運(yùn)動能力的實驗方法[8]。給藥4周后進(jìn)行，將大鼠放置于刺激源一側(cè)，打開噪聲和燈光，大鼠延橫木跑向暗箱后立即關(guān)閉噪聲，實驗在暗室中進(jìn)行，持續(xù)7 d。記錄指標(biāo)包括：整體運(yùn)動時間、起始區(qū)時間(潛伏期)及滑足次數(shù)。

2.4 認(rèn)知功能檢測

水迷宮實驗(morris water maze,MWM)實驗是評價大鼠海馬區(qū)依賴性空間記憶和學(xué)習(xí)能力的經(jīng)典行為學(xué)方法[9-10]。給藥4周后進(jìn)行，首先進(jìn)行定位巡航實驗。將水池分為4個部分，第一象限設(shè)為目標(biāo)象限并放置逃生平臺，每只大鼠依次從二、三、四象限入水尋找逃生平臺，探索時間為120 s。若找到平臺，讓大鼠繼續(xù)站臺10 s，若未找到則引導(dǎo)上臺，站臺20 s，實驗持續(xù)5 d，記錄大鼠的逃避潛伏期。在空間探索實驗中，于第6天移除逃生平臺，將大鼠從第三象限面入水，設(shè)定平臺中點(diǎn)向外2倍半徑區(qū)域為記憶有效區(qū)域，探索時間為120 s，記錄大鼠穿越平臺有效區(qū)域的次數(shù)[11]。

2.5 組織學(xué)檢測

各組實驗動物在行為學(xué)實驗后，立即處死大鼠，用生理鹽水進(jìn)行心臟灌流，待肝臟發(fā)白后，用4%多聚甲醛繼續(xù)灌流。取腦組織于4%多聚甲醛固定48h，隨后進(jìn)行洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟制備腦病理切片。用蘇木素和伊紅染液進(jìn)行常規(guī)HE染色[12]，中性樹膠封固，于20×10倍光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)的組織形態(tài)學(xué)改變。

2.6 免疫組織化學(xué)檢測

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是衡量腦組織缺血缺氧后血管重新生成的重要因素[13]。首先將包埋好的腦組織切片(厚度5um)，于65℃烘箱脫蠟12 h，PBS沖洗3次，3% H2O2孵育15 min，微波熱修復(fù)抗原15 min，PBS沖洗3次，隨后加入一抗，37℃孵育1.5 h，加入二抗，滴加DAB顯色，放入蒸餾水終止顯色。復(fù)染、HCl分化后，中性樹膠封固。光學(xué)顯微鏡拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus(IPP)圖象分析系統(tǒng)，計算各組大鼠腦內(nèi)皮質(zhì)區(qū)陽性細(xì)胞的累積光密度值(Integrated optic density, IOD)。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 CCH對精細(xì)運(yùn)動能力的影響及TAC的改善作用

各組大鼠在BBT中，整體運(yùn)動時間、潛伏期及滑足次數(shù)結(jié)果的統(tǒng)計分析見表1。整體運(yùn)動時間結(jié)果表明：與Sham組比較，Model組整體運(yùn)動時間明顯增加(P<0.01)；與Model組比較，TAC組整體運(yùn)動時間明顯減少(P<0.01)。大鼠潛伏期結(jié)果顯示：與Sham組比較，Model組的潛伏期顯著增長(P<0.01);與Model組相比，TAC組潛伏期縮短，且存在顯著性差異(P<0.05)。大鼠滑足次數(shù)結(jié)果顯示：與Sham組比較，Model組滑足次數(shù)明顯增加，表明CCH對大鼠精細(xì)運(yùn)動產(chǎn)生阻礙；與Model組比較，TAC組滑足次數(shù)明顯減少(P<0.01)。

表1 TAC在BBT中的測試結(jié)果

注：與Sham組相比，△P<0.01；與Model組相比，□P<0.05,■P<0.01

3.2 CCH對大鼠認(rèn)知功能的影響及TAC的改善作用

各組大鼠在MWM實驗中的結(jié)果見表2。在定位巡航實驗中，Model組大鼠逃避潛伏期(41.83±7.28)s與Sham組大鼠逃避潛伏期(18.06±3.90)s相比較具有顯著性差異(P<0.01)，提示CCH大鼠的學(xué)習(xí)能力下降；與Model組相比較，TAC組大鼠逃避潛伏期(35.96±6.84)s明顯縮短(P<0.05)，提示TAC可減少CCH大鼠的逃避潛伏期，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。在空間探索實驗中，Model組大鼠穿越平臺有效次數(shù)(3.10 ±1.02)次與Sham組大鼠穿越平臺的有效次數(shù)(5.12±1.80)次相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Model組比較，TAC組大鼠穿越平臺有效次數(shù)(5.60 ±1.98)次明顯增加(P<0.01)，提示TAC可改善慢性低灌注引起的學(xué)習(xí)記憶障礙。

3.3 CCH對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的影響及TAC的改善作用

各組大鼠于20×10倍光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色后海馬CA1區(qū)的組織形態(tài)學(xué)改變，實驗結(jié)果顯示，Sham組大鼠腦海馬CA1區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，染色均勻，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較多且排列較整齊。與Sham組比較，Model組大鼠CA1區(qū)細(xì)胞排列稀疏，神經(jīng)元數(shù)目較少，并伴有核固縮和空泡現(xiàn)象。與Model組比較，TAC組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)趨于正常，細(xì)胞間排列緊密，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多，提示CCH可造成腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞組織形態(tài)的改變和損傷，經(jīng)TAC治療后有明顯改善。見圖1。

表2 TAC在MWM實驗中的測試結(jié)果

注：與Sham組相比，△P<0.05,▲P<0.01；與Model組相比，□P<0.05,■P<0.01

3.4 CCH對大鼠腦海馬CA1區(qū)VEGF表達(dá)的影響及TAC的改善作用

利用光學(xué)顯微鏡于20×10倍可以觀察到VEGF陽性細(xì)胞經(jīng)DAB顯色后主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)。通過對各組大鼠陽性細(xì)胞VEGF的IOD值測定，結(jié)果顯示與Sham組相比，Model組VEGF的陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.01)，提示在缺血狀態(tài)下腦內(nèi)VEGF表達(dá)增加；與Model組比較，TAC組大鼠陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.01)，提示TAC可上調(diào)CCH大鼠VEGF的表達(dá)，促進(jìn)血管新生。見表3、圖2。

表3 各組大鼠腦海馬CA1區(qū)VEGF的表達(dá)情況

注：與Sham組相比，△P<0.01；與Model組相比，□P<0.01

注:A-Sham組；B-Model組；C-TAC組(7.0 mg/kg)；D-Nimodipine組(10.8 mg/kg)圖1 TAC對CCH大鼠腦海馬CA1區(qū)組織形態(tài)的影響(HE,×200，標(biāo)尺：20 um)

注:A-Sham組;B-Model組;C-TAC組(7.0 mg/kg);D-Nimodipine組(10.8 mg/kg)圖2 TAC對CCH大鼠腦海馬CA1區(qū)VEGF表達(dá)的影響(×200，標(biāo)尺：20 um)

4 討論

隨著人口老齡化的劇增，神經(jīng)退行性疾病如血管性癡呆、阿爾茲海默病的發(fā)病率與日俱增，而腦血管功能障礙無疑是一個促成因素[14]。CCH可誘發(fā)腦缺血缺氧，是導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙及認(rèn)知衰退的重因素，因此，開發(fā)研制治療CCH的藥物具有重大意義。目前常用的復(fù)刻慢性全腦缺血模型包括：BCCAO法和改良的Pulsinell四動脈結(jié)扎法等[15]，BCCAO法是引起認(rèn)知動能障礙和血管性癡呆最為常用的造模方法，并且與臨床上由于血流量減少所致的慢性腦缺血行為十分相似，因此本研究采用BCCAO對TAC治療CCH的作用進(jìn)行探討。

延胡索為活血、化瘀類中藥，其主要活性成分為生物堿類，許多單獨(dú)成分如紫堇堿、L-四氫巴馬汀均有對心腦血管作用的報道[16]。中藥治療是多靶點(diǎn)和各單一成分相疊加的綜合作用，近年來對TAC類有效部位作為指標(biāo)的研究相對較少，且進(jìn)展緩慢，這為延胡索今后的藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了機(jī)遇。因此本研究選用TAC為研究對象，探討其對CCH損傷的治療作用，本實驗結(jié)果也證實了上述觀點(diǎn)。

本研究采用BWT評價CCH大鼠精細(xì)運(yùn)動能力，通過改進(jìn)原有評分標(biāo)準(zhǔn)，記錄整體運(yùn)動時間、潛伏期、大鼠滑足次數(shù)，客觀的判斷CCH大鼠精細(xì)運(yùn)動能力的變化。實驗結(jié)果顯示，Model組各項指標(biāo)明顯高于Sham組，說明Model組大鼠精細(xì)運(yùn)動能力發(fā)生障礙，而TAC組大鼠各項指標(biāo)明顯小于Model組，表明給予TAC后，CCH大鼠精細(xì)運(yùn)動障礙得到改善。MWM實驗結(jié)果提示，在定位巡航實驗中，給予TAC 4周后大鼠逃避潛伏期曲線變化明顯，而Model組曲線變化幅度較小。在空間探索實驗中，Sham組和TAC組穿越平臺有效區(qū)域次數(shù)明顯增加，表現(xiàn)出對原有平臺空間記憶的能力。研究采用HE染色觀察海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)的改變，經(jīng)TAC治療后神經(jīng)細(xì)胞間排列緊密，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增加，形態(tài)趨于正常，提示TAC可改善由CCH引起的腦神經(jīng)元細(xì)胞缺失和形態(tài)改變。VEGF又稱血管通透因子，是一種高度特異性促血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，在體內(nèi)可誘導(dǎo)血管新生[17]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)TAC治療后可顯著上調(diào)VEGF陽性細(xì)胞的表達(dá)，由此推斷TAC可能通過誘導(dǎo)血管新生，改善腦缺血后的血流灌注發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究僅針對VEGF的表達(dá)進(jìn)行了研究，但具體的作用機(jī)制還有待深入探討。