張 靈，楊 勇

（1. 電子科技大學醫(yī)學院·個體化藥物治療四川省重點實驗室，四川 成都 611731； 2. 四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院藥學部，四川 成都 610072）

目前，全球真菌年感染例次超100 萬，且感染率仍在不斷升高，艾滋病、癌癥患者在晚期易受真菌感染。治療侵入性真菌感染一般要用抗真菌藥物，包括唑類、棘白菌素類等，但長期用藥易引發(fā)耐藥風險。光滑念珠菌在念珠菌感染中屬重要病原菌，耐藥性高，多以棘白菌素類相關的抗菌藥物（如米卡芬凈）等抑制。近年來棘白菌素治療失敗及念珠菌暴發(fā)感染的病例時有報道，棘白菌素耐藥率不斷升高，特別是長期接受治療的危重患者。在此，對其耐藥機制的相關研究進行了綜述，現報道如下。

1 藥物簡介

常用藥物包括卡泊芬凈、阿尼芬凈等，從組分看屬新型脂肽類化合物，目前在臨床廣泛應用，由于微生物的來源不同，適用范圍各異，且脂肪酸鏈也各有不同。

棘白菌素類藥物為廣譜抗菌藥物，可有效阻礙真菌細胞壁β-1，3- D-葡聚糖合成，抑制真菌生長代謝，并促使真菌溶解死亡。美國食品和藥物管理局（FDA）發(fā)現，該類藥對念珠菌血癥的療效確切，敏感性高，且不會引發(fā)明顯的不良反應，推薦用于侵入性念珠菌感染的治療；還發(fā)現其對造血干細胞移植患者可起到一定預防感染的作用，且療效明顯優(yōu)于唑類藥物，患者病情很嚴重并對唑類藥物有抗性的情況下，可優(yōu)先選擇棘白菌素類藥物治療[1]。

臨床研究表明，棘白菌素類藥物口服生物利用度不高，在實際應用中主要選擇效率更高的靜脈注射給藥。該類藥與血清蛋白結合率為97% ～99.8%，在人體組織中廣泛分布。

棘白菌素類藥物對大多數念珠菌屬有活性，體外環(huán)境中也可取得良好的滅菌效果，但對曲霉菌只有輕微抑制作用。該類藥物可在裂解基礎上改變菌絲的形態(tài)而殺菌。棘白菌素類藥物無法有效抑制毛霉菌屬、隱球菌屬相關真菌，但對光滑念珠菌活性很高，而在抗菌方面其機制和唑類藥物有差異[2]，高度唑類抗性菌株中存在一定外排底物，與其抗藥性密切相關[2]。棘白菌素的療效指數高，由于人體欠缺該類型葡聚糖合成酶，對大部分患者的安全性均較高，肝毒性與腎毒性較低，另外在使用過程中藥效平穩(wěn)，故在臨床使用廣泛。

2 真菌耐藥機制

棘白菌素類藥物耐藥性的受重視程度比其他抗真菌藥物弱，耐藥機制的研究有限，相關的參考資料也有較大缺失。棘白菌素類抗真菌藥物的耐藥機制在細胞層面及基因層面均表現出特異性，相關研究可從這些方面入手。

目前，真菌耐藥的形勢嚴峻，常見機制包括Fks1 介導的耐藥機制、高劑量水平下的突破生長、細胞應激反應、內源性機制等。盡管棘白菌素類藥物安全性較高，但也發(fā)現了一定的心臟毒性[3]。在抗真菌藥物中，棘白菌素類占據了重要地位。有研究發(fā)現，FKS 突變與耐藥密切相關，因而棘白菌素的敏感性就可通過檢測這種基因的突變性而確定。

3 棘白菌素類可能的耐藥機制

3.1 Fks1 介導的耐藥機制

3.1.1 Fks1 突變導致白色念珠菌敏感性降低

DENNING[4]研究發(fā)現，白色念珠菌的抗藥性可能和基因突變相關，而在一些針對該類真菌的遺傳試驗中也發(fā)現，Fks1 可能為一種靶點，而Fks1 為由Fks1 編碼的一種酶的亞基，在菌株Fks1 突變情況下可有效耐受脂肽類抗菌藥物，達到很高的耐藥性。推斷在這種基因突變影響下，棘白菌素類藥物對白色念珠菌的抗菌效果顯著降低[3]。一些學者在研究中檢測分析了該類真菌的基因突變情況，結果Fks1 的2個區(qū)域出現了點突變，相關氨基酸區(qū)也產生了一定改變。與此相關的突變主要分為S645P 和S645F 等，且在易感菌株中該區(qū)域突變情況下，對應菌株耐壓性升高，導致棘白菌素類藥物的抗菌效果顯著降低。而這種藥物活性的降低是否是因為該區(qū)域含這類藥物的結合區(qū)，目前尚無定論。

Fks1 的F639I 在酵母菌中的作用相同，對比分析發(fā)現其機制也類似。由此可判斷，HS 區(qū)域的突變對該藥物的耐藥產生明顯影響。同一患者各處采集的菌株存在一定差異，這些菌株的Fks1 突變不一致，不過在這種突變影響下都會產生耐藥性。多位點序列研究結果表明，這些突變菌株的表型無明顯差異性，耐藥性的影響因素復雜，多種環(huán)境或因素都可引發(fā)[5]。WIEDERHOLD 等[6]選擇相關的合成酶為對象進行分析，所得結果促進了對Fks1 突變和耐藥性的研究。研究發(fā)現，HS 突變會降低其藥物敏感性[5]。對比分析結果表明，卡泊芬凈對S645P突變酶的抑制濃度顯著升高；在HS1 區(qū)C 位末端突變情況下獲得的酶，其耐藥性明顯低于其他突變[6]。

此外，耐藥性也和單一的Fks1 突變相關，由此可判斷出HS 區(qū)域突變很大可能為顯性，而其純合子的突變會引發(fā)耐藥性。BOWMAN 等[7]選擇鼠感染模型進行模擬研究，所得結果基本一致。有研究對比分析了2個等位基因都產生突變的分離株，結果99%的個體產生效應的劑量（ ED99）增幅最大可到野生型的1000 倍；對應的雜合子的ED99增幅最大可到野生型的70 倍[8]。表明通過動物模型可對其純合子和雜合子進行高效區(qū)分，也可在此基礎上對該細菌的敏感性進行評價。通過臨床抗性的氨基酸變化譜（見表1）可明確基因類型。

表1 賦予臨床抗性的Fks 氨基酸變化譜

3.1.2 Fks1 機制導致其他念珠菌敏感性降低

從患者體內采集獲得的耐藥性菌株，對應的耐藥機制均與Fks1 機制有關，如都柏林念珠菌等[9]。進一步研究發(fā)現，該類菌株對棘白菌素類的耐藥性基本一致，且耐藥機制相同，并在HS 區(qū)域也發(fā)現了明顯的基因突變。在Fks2 的HS1 突變情況下，光滑念珠菌也表現出一定耐藥性，針對克柔念珠菌的檢測結果表明，耐藥菌株中出現了HS1 突變[9]。該結論也證明了HS 區(qū)域突變相關的葡聚糖合成酶的藥物敏感性降低，其耐藥機制可能如此。該類藥物對平滑念珠菌相關感染的效果顯著，最低抑菌濃度（MIC）更高（0.5 ～8.0 μg／mL），且明顯高于同類型真菌。進一步分析發(fā)現，這種差異很有可能與Fks1 HS1／HS2 區(qū)域的氨基酸多態(tài)性相關。

在近平滑念珠菌中，Pro649 氨基酸表現出隨機多態(tài)性，對比分析結果表明，該種真菌中同樣存在相應P649A 多態(tài)性，而對比發(fā)現其敏感性有一定降低。試驗結果表明，其HS2 區(qū)域中同時還存在I1359V 多態(tài)性，在此因素影響下，相應的MIC 更高[10]?？梢?，非白色念珠菌的這種耐藥性大部分都和HS1 和HS2 區(qū)域突變引發(fā)的fks1 多態(tài)性相關，可據此解釋其耐藥性。

3.1.3 Fks1 機制導致曲霉菌敏感性降低

MORRISON 等[11]針對煙曲霉進行了研究，檢測到該類耐藥性，并通過基因技術將白色念珠菌Fks1-S645Y 突變導入到煙曲霉中進行對照分析，發(fā)現菌株藥物敏感性顯著下降，但該耐藥性僅在試驗條件下存在，其他情況尚不明確。

3.2 高劑量水平下的突破生長

突破生長屬特定的生長模式，為敏感菌株在顯著超過MIC 的藥物濃度條件下的生長。研究發(fā)現，該類生長可能和細胞適應性有關，并非和fks1 突變相關，和藥物敏感性改變無相關性[12]。白色念珠菌生長后，相應細胞壁中的殼多糖組分占比大幅提高[13]?？梢姡撋L現象可能為細胞對抗菌藥物治療相關的β-（1，3）- D-葡聚糖減少癥的代償機制。MILLER 等[14]建立了鼠科肺部曲霉病模型，發(fā)現模型動物體內的菌株也存在該類生長現象，而臨床未觀察到類似現象，推測可能只有在實驗室條件下存在，側面說明同時存在其他類型耐藥性機制。

3.3 細胞應激反應

NIIMI 等[15]的研究中設置了1個酵母敲除突變株庫，以分析這類細菌調節(jié)敏感性的途徑和模式，結果顯示，敲除基因后藥物敏感性提高。而與此相關的基因功能涉及磷脂肌醇信號途徑（PKC）完整性、麥角固醇合成、轉錄調控，敲除和信號轉換等有關環(huán)節(jié)，相應敏感性會有一定下降。BACHMANN 等[16]的研究結果表明，敲除52個基因或這種菌株可大幅提高對卡泊芬凈的敏感性，而敲除39個基因的效果相反。sbe2 屬高爾基體蛋白基因，與細胞壁成分的合成關系密切，其表達水平過高會引發(fā)低水平的抗性?？梢?，復雜途徑網絡可改變細胞對該類藥物的敏感性[17]，不過細菌的抗性是適度的，對其機制分析發(fā)現，此種抗性可視為細胞耐受性，即在一定環(huán)境壓力條件下，細胞生理上進行調節(jié)而適應環(huán)境，但和耐藥性并不等同。

細胞壁的合成和修復對于細胞的生長代謝有重要意義，在此過程中基因起著重要的調節(jié)作用，決定了細胞壁的合成速度，在不同細胞壓力條件下細胞壁會產生對應的應激反應。真菌細胞壁合成過程中，由于會大量出現相應的聚合體，該類物質和細胞修復密切相關，也會多次出現修飾現象，頻發(fā)重排現象。棘白菌素類藥物在使用后可有效抑制真菌的細胞壁合成，阻礙了真菌生長代謝，且據此實現殺菌效果。葡聚糖合成酶可催化β-（1，3）- D-葡聚糖的合成，后者為細胞壁的主要成分，屬耐藥性的靶點，其包括催化亞基Fks1（或Fks2）與激活因子Rho1。Rho1 可通過調節(jié)作用大幅提高葡聚糖合成酶的活性，進一步分析還發(fā)現其和細胞壁的合成也緊密相關，且調節(jié)路徑可能為細胞完整性[18]。外界刺激影響下會產生細胞壁應激，該應激可通過受體Wsc1 介導產生復雜的次級交互作用。相關研究發(fā)現，鈣調磷酸酶基于Crz1 對Fks1 產生一定影響[19]。還有殼多糖合成酶基因chs1／2／3／8 的調整。轉錄因子Rlm1 可調節(jié)PKC水平，同時也影響細胞壁相關基因的表達。Wsc1 與卡泊芬凈相關的細胞壁損傷有關，可使肽Slt2 處于激活狀態(tài)，后者可促使保護應答，對細胞壁的合成起到調節(jié)和控制作用。研究發(fā)現，β-（1，3）- D-葡聚糖的裝配亞基主要有β-（1，3）- D-葡聚糖合成酶，和這些亞基相關的基因fks1，與對細胞壁極化產生調節(jié)作用的基因相連而產生一定結構的途徑網絡[20]。該網絡可對來自棘白菌素類藥物的壓力刺激進行調節(jié)，影響藥物敏感性?；蚪M的藥物敏感性研究結果表明[21]，在卡泊芬凈刺激下，和細胞壁合成相關的基因表達有一定改變，但差異很小。這種耐受性和PKC 途徑密切相關。

3.4 內源性耐藥機制

目前常見的真菌包括有鐮刀菌屬、接合菌等，研究發(fā)現，該類真菌均存在一定內源性耐藥性，定量分析表明其MIC 超過16 μg／mL[22]。目前關于該內源性耐藥機制的研究尚無明確結果。從體外分析結果來看，這幾種類型的葡聚糖合成酶對卡泊芬凈敏感性很高，表明該類型耐藥和靶位不相關[8]。曾鳳群等[23]通過形態(tài)學終點分析法進行的最低效應濃度研究結果表明，曲霉菌等對卡泊芬凈有很強的敏感性。由此也可判斷，上述幾種類型的霉菌中含有一些和Fks1 存在明顯差異性的耐藥機制?？梢姡@類型真菌的耐藥性機制相對復雜，需滿足一定前提條件，在達到一定活性位點的情況下，才會導致耐藥性。其他如藥物修飾的作用途徑尚未被證實，但也可能起了一定作用。

4 結語

棘白菌素類藥物的耐藥機制復雜且與多種因素相關。一些關于光滑念珠菌菌株的研究表明，在不規(guī)范用藥等因素影響下，該類藥物也開始表現出較高的多藥耐藥性[23]。穩(wěn)定耐藥性的FKS 機制已被深入研究，以后的研究中應明確遺傳因素和FKS 突變的相關性，為抑制該類耐藥性提供支持。真菌細胞在一定的代償途徑下會出現很強的應激反應，可在此基礎上有效提高對藥物的反應，且利用一些特征性的FKS 熱點突變而實現耐藥。簡言之，耐藥性的影響因素主要有藥物長期暴露、宿主微生物庫形成等，為有效應對耐藥性問題，需開展相關抗藥性試驗以利于更好地診斷，且對治療方案和用藥劑量進行優(yōu)化，從而應對耐藥性問題。

細胞應答與適應機制也可對這種耐藥性產生影響，不過關于fks1 突變機制相關耐藥性尚不確定，很少產生由于棘白菌素耐藥相關的無效病例，因而尚未引起重視。但隨著該類藥物的不斷使用，其引發(fā)的問題也會持續(xù)表現。故有必要對該類耐藥機制進行深入研究，為提高其臨床療效提供支持。同時，還需規(guī)范抗真菌藥物的合理使用，不斷優(yōu)化用藥方案，盡可能降低藥物使用頻率，從而減緩真菌對棘白菌素類藥物耐藥的發(fā)生。