姜鴻瑞，姜 惠，梁煥結，周靜鵬，韓紫音，毛永江，冀德君，楊章平，張慧敏

(揚州大學 動物科學技術學院，江蘇 揚州 225009)

奶牛乳房炎是奶牛業(yè)危害最大，也是最常見的疾病之一，它不僅影響奶牛的健康狀況，而且影響牛奶品質，給農(nóng)民和乳制品行業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[1]。病原微生物是誘發(fā)奶牛乳房炎的主要原因之一，迄今為止已發(fā)現(xiàn)了150余種乳房炎致病菌，其中大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、肺炎克雷伯菌、蠟樣芽胞桿菌等比較常見[2-3]。這些致病菌通過乳頭導管入侵，引起感染。目前，注射抗生素是治療奶牛乳房炎最常用的方法，然而長期使用抗生素會導致奶牛出現(xiàn)抗藥性，最終引起奶牛乳房炎的復發(fā)和慢性感染[4]。所以有必要對奶牛乳房進行有效的保護，預防乳房炎的發(fā)生。

目前最有效的預防手段是乳頭藥浴劑，常見的主要有過氧化物類、堿類、碘與碘化物、含氯化合物、季銨鹽類等[5]，它們大都是水溶液型，殺菌力維持時間短，且長期使用可對乳頭皮膚有刺激作用[6]。為此，本試驗室前期研制了一種成膜性奶牛乳頭藥浴劑，使用該產(chǎn)品后在乳頭上形成一層保護膜，可有效防止細菌侵入，從而預防乳房炎的發(fā)生[7]，但其主效殺菌成分為聚維酮碘，含量較高，存在牛奶中碘殘留的隱患，對食品安全有一定影響[8]。

殼聚糖是一種天然聚陽離子多糖，無毒無害，具有良好的生物相容性和成膜特性，廣泛存在于甲殼類動物、節(jié)肢動物中[9]。殼聚糖及其衍生物具有抗感染、抗腫瘤、降血脂、增強免疫功能和抗菌等多種作用[10]。但不同相對分子質量殼聚糖的抑菌效果不盡相同，Asli等[11]發(fā)現(xiàn)相對分子質量為(1.3～4.0)×103的殼聚糖對金黃色葡萄球菌的抑菌效果要優(yōu)于相對分子質量為(0.4～0.6)×103的殼聚糖。目前，已有報道表明相對分子質量為(50～90)×103的殼聚糖與鄰氯青霉素復配使用，可有效地抑制金黃色葡萄球菌[12]?？梢姎ぞ厶窃诜乐文膛Ｈ榉垦追矫婢哂芯薮蟮膽脻摿?。

因此，本研究首先考察不同相對分子質量的殼聚糖對奶牛乳房炎致病菌的體外抑菌效果，然后以殼聚糖和聚維酮碘為主效消毒成分研制奶牛乳頭保護膜，通過體外抑菌試驗及奶牛臨床試驗，評價殼聚糖乳頭保護膜對奶牛隱性乳房炎的預防效果，該研究以期為擴大殼聚糖在奶牛乳房炎防治方面的應用，開發(fā)殼聚糖相關的綠色獸藥產(chǎn)品提供科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌(EscherichiacoliNBRC102203)、綠膿桿菌(PseudomonasaeruginosaDSM 50071)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC12600)、無乳鏈球菌(StreptococcusagalactiaeATCC 13813)、肺炎克雷伯菌(KlebsiellapneumoniaDSM 30104)、蠟樣芽胞桿菌(BacilluscereusATCC14579)菌株由本試驗室保存。

1.2 試劑

殼聚糖(5～350)×103，脫乙酰度為91%～92%)購自浙江金殼藥業(yè)有限公司；成膜性乳頭藥浴劑由本試驗室研制，由成膜材料、抑菌成分、保濕成分等組分構成；對照組為市場上常規(guī)藥浴液聚維酮碘，購自南京日升昌生物技術有限公司。

1.3 微生物的培養(yǎng)

將金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌液接種于血平板瓊脂培養(yǎng)基中，其余菌種接種于普通瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.4 殼聚糖水溶液的制備

稱取12 g殼聚糖加入98 mL無菌水、2 mL乙酸，使其溶解，調(diào)節(jié)pH至6.0～7.0。

1.5 殼聚糖保護膜的制備

乳頭保護膜的具體配制方法參照文獻[7]并稍作修改，其中殼聚糖的終濃度分別為0.0%、0.5%、1.0%、1.5%，聚維酮碘的終濃度均為4.0%。

1.6 最低抑菌濃度(MIC)的測定

在試管中將6種菌液的濃度稀釋至106CFU/mL左右，加入殼聚糖溶液，使殼聚糖溶液的濃度依次稀釋成8%、4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%。37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h，最后一個無菌生長的試管所對應的殼聚糖濃度即MIC。

1.7 抑菌效果評價

取150 μL菌液(106CFU/mL)涂布于相應的培養(yǎng)基中，在平皿內(nèi)打孔(直徑為7.58 mm)，每板2個，將不同相對分子質量的殼聚糖或保護膜溶液分別注入孔內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑。

1.8 乳區(qū)對比試驗

選取處于泌乳期的健康中國荷斯坦奶牛48頭，每頭奶牛左側2個乳區(qū)作為試驗組，右側2個乳區(qū)作為對照組。每次擠奶后，分別浸入殼聚糖乳頭保護膜藥浴劑和普通碘制劑中藥浴3 s，每天3次，試驗持續(xù)期為28 d。于試驗0、7、14、21、28 d分別進行LMT隱性乳房炎檢測[13]。此外于試驗0、14、28 d分乳區(qū)收集奶樣，采用多功能乳成分快速分析儀(MilkoScan FT120，F(xiàn)OSS)進行乳脂率、乳蛋白率、乳糖含量、總固體含量和SCC測定。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 16.0中的單因素ANOVA方差分析模型，分析殼聚糖不同相對分子質量或不同添加量對6種致病菌抑菌效果的影響；乳區(qū)試驗中試驗組和對照組間乳成分、SCC和SCS的差異用t檢驗法進行分析。試驗結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 不同相對分子質量殼聚糖的抑菌活性

MIC試驗結果見表1。不同相對分子質量的殼聚糖對6種乳房炎致病菌均有抑制效果，其中50×103殼聚糖針對金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌的MIC最低，為0.25%，針對其余4種致病菌的MIC為0.50%，較其他相對分子質量殼聚糖的MIC低。5×103和350×103的殼聚糖MIC范圍在4%～8%，顯著高于其他相對分子質量殼聚糖的MIC。而150×103的殼聚糖MIC范圍在0.50%～1.00%之間，略高于50×103殼聚糖的MIC。

將不同相對分子質量的殼聚糖進行抑菌試驗，由表2可以看出5×103的殼聚糖對6種致病菌均無抑制效果，50×103、150×103和350×103的殼聚糖對6種致病菌均有不同程度的抑制作用。三者均對大腸桿菌的抑菌作用最強，對肺炎克雷伯菌的抑菌作用最弱。方差分析表明：殼聚糖的相對分子質量對6種致病菌的抑菌效果影響極顯著(P<0.01)，其中50×103殼聚糖對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、蠟樣芽胞桿菌的抑菌圈直徑要顯著大于150×103和350×103的殼聚糖，對大腸桿菌和無乳鏈球菌的抑菌效果要顯著高于350×103的殼聚糖(P<0.05)。結合MIC和抑菌效果試驗結果，發(fā)現(xiàn)相對分子質量為5×103的殼聚糖對奶牛乳房炎常見致病菌具有較好的抑制效果，將其應用于下一步的殼聚糖保護膜試驗中。

注：同行數(shù)據(jù)上標字母相同表示差異不顯著，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:The same letter superscripts in the same row mean insignificant difference, different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same below.

2.2 殼聚糖乳頭保護膜藥浴劑的抑菌試驗結果

由表3可知，不同殼聚糖添加量的保護膜對6種致病菌均有不同程度的抑制作用，0.50% 殼聚糖添加量的保護膜對肺炎克雷伯菌的抑菌作用最強，1.00%和1.50%添加量的保護膜則對蠟樣芽胞桿菌的抑菌作用最強。無殼聚糖添加組對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌的抑菌效果顯著低于1.00%和1.50%添加組(P<0.05)；1.00%和1.50%添加組對6種致病菌的抑制效果無顯著差異(P>0.05)。因此，可采用1.00%殼聚糖添加量的乳頭保護膜藥浴劑開展臨床試驗。

表3 不同殼聚糖添加量的乳頭保護膜對6種致病菌的抑菌效果Table 3 The antibacterial effect of teat dips with different chitosans content mm

2.3 隱性乳房炎的發(fā)病情況

由表4可知，對照組可疑及陽性乳區(qū)數(shù)量雖在7 d時出現(xiàn)了下降，但隨后一直上升，最后由試驗前的6個增至14個，占總乳區(qū)數(shù)的14.58%。試驗組的可疑及陽性乳區(qū)在7 d和21 d時出現(xiàn)了下降，但最后由試驗前的8個增至9個，占總數(shù)的9.38%，增幅遠遠低于對照組。與對照組聚維酮碘藥浴劑相比，試驗組殼聚糖乳頭保護膜可有效地預防隱性乳房炎。

2.4 SCC及SCS變化情況

試驗前后牛奶中的體細胞數(shù)檢測結果見表5。0、14、28 d時，對照組和試驗組之間的SCC及SCS均無顯著差異(P>0.05)。從不同時間段來看，對照組3個時間段的SCC變化不顯著，而試驗組14 d的SCC顯著低于0 d(P<0.05)；14 d和28 d對照組和試驗組的SCS均顯著低于0 d(P<0.05)。結果表明殼聚糖乳頭保護膜藥浴劑能很好的降低乳中的體細胞數(shù)。

表4 LMT檢測結果Table 4 The result of LMT test

表5 SCC及SCS檢測結果Table 5 The result of SCC and SCS

注：同行數(shù)據(jù)上標*表示差異顯著(P<0.05)；同列數(shù)據(jù)上標字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: In the same row, values with * mean significant difference (P<0.05). In the same column, values with the same or no letter superscripts mean insignificant difference (P>0.05), while different lowercase superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.5 乳成分變化情況

乳成分檢測結果見表6，0、14、28 d時，對照組和試驗組之間的乳成分指標均差異不顯著(P>0.05),表明殼聚糖乳頭保護膜藥浴劑對乳品質無顯著影響。

3 討 論

乳頭藥浴劑是一種預防乳房炎的有效措施。擠奶后乳頭迅速浸泡藥浴劑，可有效殺死病原菌，從而預防乳房炎的發(fā)生。目前常用的藥浴劑大都含有高劑量的碘，它對乳頭皮膚有一定的刺激性，且絡合碘中所用的表面活性劑長期使用還存在一定的毒性[14]。因此后藥浴液在具有足夠殺菌力的同時，要求碘的含量要低。殼聚糖是一種可降解的生物大分子，它無毒無害，且具有良好的抗菌性能，已廣泛地應用在食品、藥品及飼料等行業(yè)中。此外，殼聚糖還具有良好的成膜特性[15]，將其引入成膜性乳頭藥浴劑中，不僅可以提高殺菌效果，降低碘的含量，同時又可以促進膜的形成，改善成膜性藥浴劑在乳頭上出現(xiàn)的“下滴現(xiàn)象”。

表6 乳成分檢測結果Table 6 The result of milk composition determination %

許多研究表明，殼聚糖的抑菌效果與相對分子質量的大小有關，低相對分子質量的殼聚糖可進入細胞內(nèi)部，吸附細胞質內(nèi)的陰離子，發(fā)生絮凝作用，干擾細胞新陳代謝進而殺死細菌，而高相對分子質量的殼聚糖可吸附在細胞表明，形成一層高分子膜，阻礙營養(yǎng)物質的運輸從而達到殺菌作用[16-17]。由于不同細菌細胞壁結構的不同，所以不同相對分子質量殼聚糖對細菌的抑制程度也不盡相同。MIC試驗結果表明，相對分子質量為5×103和350×103的殼聚糖對6種乳房炎致病菌的抑制效果不明顯。而50×103的殼聚糖對6種致病菌的抑制效果較好，它對乳房炎主要致病菌金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌的MIC為0.25%，而隨著相對分子質量的上升，殼聚糖對6種致病菌的抑制效果又逐漸下降。該試驗結果與胡瑛等[18]的研究結果相一致：隨著相對分子質量的升高，殼聚糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的抑菌活性先升高后降低。抑菌圈試驗結果顯示，50×103殼聚糖對奶牛乳房炎常見致病菌具有較好的抑制效果，而5×103的殼聚糖對6種致病菌沒有抑制效果，該研究結果與宋獻周和沈月新[16]報道一致，相對分子質量小于5×103的殼聚糖不僅對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌沒有抑菌作用，反而能促進細菌的生長。分析原因可能是殼聚糖小分子可進入細胞內(nèi)部，不僅不干擾細菌的新陳代謝，反而作為一種多糖物質，促進細菌的生長增殖。

將殼聚糖加入至試驗室前期研發(fā)的成膜性乳頭藥浴劑中，通過抑菌圈試驗發(fā)現(xiàn)，添加1%相對分子質量為50×103殼聚糖的藥浴劑對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、蠟樣芽胞桿菌的抑菌圈要顯著大于未添加殼聚糖的對照組。體外抑菌試驗顯示乳頭藥浴劑中加入殼聚糖可有效的提升保護膜的抑菌效果。臨床試驗采用的是乳區(qū)對比試驗，將同一頭牛的左右乳區(qū)分別浸入殼聚糖乳頭保護膜藥浴劑和聚維酮碘藥浴劑，降低了奶牛個體差異對試驗的影響，使得結果更加準確。試驗28 d后，試驗組和對照組隱性乳房炎的發(fā)病率分別為9.38%和14.58%，可見試驗組的隱性乳房炎發(fā)病率明顯低于對照組。

SCC是衡量奶牛感染乳房炎嚴重程度的一個關鍵指標，但由于其偏態(tài)分布，在科學研究和生產(chǎn)中常將其轉化為屬于典型正態(tài)分布的SCS[19]。目前，大多數(shù)國家均將它們作為奶牛乳房炎抗性的一個主要性狀加以追蹤[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗28 d后，試驗組的SCC從130.01×103/ mL下降至73.34×103/mL，SCS從1.28下降至0.85，而對照組的SCC降低不顯著。由此可看出，與對照組10%的聚維酮碘藥浴劑相比，試驗組的殼聚糖乳頭保護膜藥浴劑雖然僅含有4%的聚維酮碘，但可有效地預防隱性乳房炎。與普通水溶性藥浴劑相比，成膜性乳頭藥浴劑預防隱性乳房炎的效果更佳，因為它可在乳頭表面形成一種長效抗菌保護膜，縮短乳頭管的開放時間，從而有效降低致病菌入侵的幾率，同時在兩次擠奶間隙保護乳頭，防止墊料、飼料等環(huán)境性致病菌的侵入[21]。

4 結 論

本研究結果表明殼聚糖乳頭保護膜藥浴劑對防治奶牛隱性乳房炎效果明顯，且對乳品質無顯著影響，是一種操作簡易、綠色、安全有效的藥浴劑，該研究不僅為新型防治奶牛乳房炎獸用藥浴劑的研發(fā)提供了思路，而且對推動奶牛健康養(yǎng)殖具有重要的意義。