簡仕燕,楊 康,王 菲,馬政發(fā),郭子義,吳文旋,2,3*,吳佳海,牟瓊

(1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究所，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 新農(nóng)村發(fā)展研究院，貴州 貴陽 550025；3.貴州山地畜禽糞便污染防控與資源化工程實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；4.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006)

低血鈣是一種營養(yǎng)代謝性疾病，由于奶畜不能充分動(dòng)用骨鈣、腸鈣吸收率降低、產(chǎn)后分泌初乳等原因造成鈣損失過多，血鈣濃度明顯降低，嚴(yán)重可誘發(fā)真胃移位、胎衣不下、乳房炎等疾病，嚴(yán)重影響奶畜生產(chǎn)性能[1]，是動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)界致力解決的重要課題。歷經(jīng)灌服水溶性鈣鹽、注射維生素D或其活性形式(1,25-(OH)2D3)、產(chǎn)前飼喂低鈣日糧等處理后，Block[2]報(bào)道降低日糧陰陽離子差(dietary cation-anion difference, DCAD)可增加鈣吸收、提高血鈣水平、維持血鈣穩(wěn)恒、防治低血鈣，為該領(lǐng)域后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)[3-4]，而在飼糧中添加陰離子鹽降低DCAD已成為當(dāng)前防治低血鈣的最常用手段[5]。

Ca2+的吸收包括3個(gè)步驟：首先，Ca2+經(jīng)瞬時(shí)受體電位通道香草酸受體6(Transient receptor potential vanilloid receptor 6，TRPV6)介導(dǎo)順濃度梯度擴(kuò)散入胞；其次，入胞后Ca2+即與鈣結(jié)合蛋白(Calcium binding protein D9k, CaBP-D9k)結(jié)合，并由細(xì)胞刷狀緣膜頂膜轉(zhuǎn)運(yùn)至基底膜；最后，Ca2+在基底膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞膜鈣泵(Plasma membrane Ca-ATPase 1b，PMCA1b)和鈉鈣交換體1(Na+/Ca2+exchanger1，NCX1)的作用下，逆濃度梯度由基底膜跨膜出胞，進(jìn)入血液[6]。上述3個(gè)步驟均受維生素D受體(VDR)的調(diào)控。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+吸收相關(guān)蛋白表達(dá)水平的提高與增加血鈣濃度緊密相關(guān)[7-9]。CaBP-D9k、TRPV6和VDR可調(diào)控Ca跨細(xì)胞膜在腸道吸收這一途徑，CaBP-D9k、TRPV6、VDR的表達(dá)水平越高，意味著鈣的吸收越高，提示降低 DCAD 水平可上調(diào)這3個(gè)基因的表達(dá)水平而增強(qiáng)鈣的吸收[10]。在本課題組開展的不同DCAD水平對(duì)羊血CaBP-D9k[7]、VDR[9]含量和瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)[11]的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)重點(diǎn)研究低DCAD水平飼糧對(duì)血鈣穩(wěn)恒及其調(diào)控因子水平與瘤胃內(nèi)發(fā)酵參數(shù)的效應(yīng)，為低DCAD防治低血鈣和探討山羊健康狀況提供技術(shù)積累和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以6只體況良好、年齡(3.5±0.2歲)、體重相近(42.6±2.1 kg)的黔北麻羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，將其分為處理組和對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只羊。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，由精料和羊草干草構(gòu)成，設(shè)計(jì)DCAD(DCAD=Na+K-Cl-S, mmol/kg DM)水平為+150。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和課題組前期研究結(jié)果，處理組在對(duì)照組日糧基礎(chǔ)上添加陰離子鹽MgSO4·7H2O，設(shè)計(jì)DCAD水平為-150。山羊日糧精粗比為40:60，組成及營養(yǎng)水平見表1。經(jīng)測定，設(shè)計(jì)DCAD水平和實(shí)際測量值略有差異。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)共持續(xù)47 d，前10 d觀察山羊采食和健康狀況，然后進(jìn)入為期30 d的試驗(yàn)期。試驗(yàn)期分為2個(gè)階段，每個(gè)階段持續(xù)15 d。每個(gè)階段的前10 d為預(yù)飼期，主要觀察山羊采食MgSO4·7H2O的適應(yīng)性，后5 d為采樣期。每個(gè)階段結(jié)束后，持續(xù)7 d采食對(duì)照飼糧，消除處理殘留效應(yīng)。試驗(yàn)期間羊舍保持干燥，自然通風(fēng)，山羊單飼于代謝籠中，留有運(yùn)動(dòng)空間。日飼3次，飼喂時(shí)間分別為8:00、13:00、18:00。山羊自由采食和飲水。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 日糧常規(guī)養(yǎng)分與DCAD 自預(yù)飼期開始，每天采集飼糧樣品，試驗(yàn)結(jié)束后混勻并制成分析樣品，檢測常規(guī)養(yǎng)分：粗蛋白質(zhì)(Crude protein, CP)、中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber, ADF)、粗灰分(Ash)、粗脂肪(Ether extract, EE)、鈉(Na)、鉀(K)、氯(Cl)、硫(S)。CP采用凱氏定氮法，NDF、ADF采用Van Soest法，EE采用乙醚浸提法，Ash采用灼燒法，氯(Cl)采用硝酸銀滴定法(GB/T6439-92)測定，硫(S)含量采用硝酸鎂法(GB/T17776-1999)測定[12]，鈉(Na)、鉀(K)含量采用原子吸收法測定(試劑盒購自北京三雄科技公司)。DCAD計(jì)算公式：DCAD(mmol/kg DM)=Na(%)/0.0023 + K(%)/0.0039-Cl(%)/0.00355-S(%)/0.0016。

表1 山羊日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrition levels for diets of goats(DM basis)

注：①組成及水平：玉米67% ，豆粕 7%，麥麩 11%，菜籽餅 11%，預(yù)混料 2%，碳酸氫鈣 1%，食鹽 1%。每kg預(yù)混料含：VA 300～500 IU,VD3 150～220 IU,VE 850 IU,Fe 1 500～5 000 mg,Cu 500～620 mg，Mn 1 500～4 000 mg，Zn 2 000～3 500 mg,I 50～200 mg，Se 10～20 mg，Co 20～40 mg，Lys 10 000 mg。

Notes:① Composition and nutritional level: corn 67%，soybean meal 7%, wheat bran 11%，rapeseed cake 11%，premix 2%，CaHPO41%，NaCl 1%。The premix per kg contains: VA 300～500 IU,VD3150～220 IU,VE 850 IU,Fe 1 500～5 000 mg,Cu 500～620 mg，Mn 1 500～4 000 mg，Zn 2 000～3 500 mg,I 50～200 mg，Se 10～20 mg，Co 20～40 mg，Lys 10 000 mg.

1.3.2 尿液pH 從每期正試期開始持續(xù)至試驗(yàn)結(jié)束，連續(xù)5 d，每天在采食2 h后用精密pH試紙(pH范圍為5.4～7.0，6.4～8.0，上海試劑三廠)蘸取新鮮尿液與標(biāo)準(zhǔn)板比對(duì)，記錄尿液pH，以此判定山羊尿液pH變化情況。

1.3.3 血液指標(biāo) 晨飼前(7:00)用肝素抗凝管從頸靜脈采血10 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清血漿置于-20 ℃冰箱保存，試驗(yàn)結(jié)束后采用試劑盒法測定血漿Ca、甲狀旁腺素(Parathyroid hormone, PTH)、降鈣素(Calcitonin, CT)、1,25二羥基維生素D3(1,25-(OH)2VD3)、瞬時(shí)性受體電位通道香草酸受體亞型6(transient receptor potential vanilloid 6, TRPV6)、維生素D受體(VDR)。上述指標(biāo)檢測試劑盒均購自南京建成生物公司。

1.3.4 瘤胃發(fā)酵參數(shù) 采用胃管式瘤胃液采樣器于晨飼前采取瘤胃液，4層紗布過濾后測定瘤胃液發(fā)酵參數(shù)，包括：瘤胃液pH、氨態(tài)氮濃度(NH3-N)。其中，瘤胃液pH用便攜式pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器FG2-ELK)測定，氨態(tài)氮濃度參照文獻(xiàn)[13]方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 干物質(zhì)采食量

處理組山羊干物質(zhì)采食量在預(yù)飼期前3 d稍低，經(jīng)適應(yīng)后逐漸恢復(fù)至與對(duì)照組基本一致水平，對(duì)照組、處理組分別為940.8±3.85和932.3±6.76 g/d，差異不顯著(P>0.05)，說明添加陰離子鹽未對(duì)山羊飼糧適口性產(chǎn)生影響。

2.2 尿液pH

對(duì)照組和處理組山羊尿液pH分別為7.8±0.10和6.4±0.07，差異顯著(P<0.05)，說明處理組山羊采食低DCAD水平飼糧后尿液明顯酸化。

2.3 血漿代謝指標(biāo)

由表2可知，處理組血漿Ca2+濃度高于對(duì)照組12.3%(P<0.05)。血漿VDR、TRPV6、PTH濃度變化與DCAD水平呈相反趨勢，即DCAD水平降低，血漿VDR、TRPV6、PTH濃度升高。處理組VDR、TRPV6、PTH分別高于對(duì)照組17.2%、20.8%、30.4%(P<0.05)。兩組1,25-(OH)2VD3、CT水平接近，差異不顯著(P>0.05)。

2.4 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

處理組的瘤胃液pH和NH3-N濃度分別為6.48±0.37和6.46±0.17，與對(duì)照組(分別為6.80±0.16和6.24±0.19)差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 不同DCAD水平日糧對(duì)山羊干物質(zhì)采食量的影響

動(dòng)物采食量與其生長發(fā)育和生產(chǎn)性能的密切相關(guān)，是評(píng)價(jià)降低DCAD水平是否適宜首要考慮的問題，與飼糧適口性、環(huán)境、飼養(yǎng)管理方式等因素有關(guān)[14]。DCAD為負(fù)值的日糧通常具有苦澀味，會(huì)造成干物質(zhì)采食量下降[15]。本試驗(yàn)中，處理組山羊的干物質(zhì)采食量未明顯降低，說明山羊可適應(yīng)本試驗(yàn)所用陰離子鹽(MgSO4·7H2O)的味道。此結(jié)果得到前人研究報(bào)道的支持[16-18]，同時(shí)與本課題組前期的研究結(jié)果[19]一致。

表2 不同DCAD水平飼糧對(duì)山羊血鈣及其代謝因子水平的影響Table 2 Effect of different DCAD levels of diets on blood calcium and its metabolism associated factors in goats

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)為相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Notes: In the same row, values with the same or no letter superscripts mean insignificant difference (P>0.05), while different lowercase superscripts mean significant difference (P<0.05).

3.2 不同DCAD水平日糧對(duì)山羊尿液pH的影響

采食低DCAD飼糧可誘導(dǎo)機(jī)體輕度代償性酸中毒，DCAD水平與尿液pH及血液pH之間呈顯著性相關(guān)[20]。尿液pH收集、測量便捷，對(duì)機(jī)體應(yīng)激小，尤其對(duì)DCAD水平敏感性強(qiáng)，可作為量化DCAD水平的指標(biāo)。試驗(yàn)表明，尿液pH會(huì)隨DCAD降低而下降[21]，這是因?yàn)椴墒矰CAD飼糧，根據(jù)強(qiáng)離子差理論，Cl-、S2-被機(jī)體吸收后，可在腎臟中產(chǎn)生相應(yīng)的負(fù)電荷，機(jī)體為了維持溶液電中性和電離平衡而分泌排出相應(yīng)的H+，使血液中的陰離子水平高于陽離子水平，從而導(dǎo)致尿液pH降低[22]。本試驗(yàn)中處理組尿液pH顯著低于對(duì)照組，這與Goff和Horst[23]試驗(yàn)結(jié)果一致，其認(rèn)為降低DCAD后尿液pH的理想數(shù)值為5.5～6.5，在這個(gè)范圍可保證腎臟離子代謝不紊亂和較高的血鈣水平?？傮w而言，降低DCAD水平，可使尿液pH降低。

3.3 不同DCAD水平對(duì)山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

3.3.1 瘤胃pH 瘤胃pH是食糜VFA與唾液緩沖鹽相互作用、以及瘤胃上皮對(duì)VFA吸收及食糜排出等因素綜合利用的結(jié)果，是反映瘤胃酸堿平衡狀況和瘤胃微生物環(huán)境的重要指標(biāo)。鑒于瘤胃pH絕對(duì)水平的重要性，Iwaniuk和Erdman[24]統(tǒng)計(jì)分析了DCAD水平與瘤胃pH的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)在0～550范圍內(nèi)，飼糧DCAD水平每升高100個(gè)單位，瘤胃pH僅上調(diào)0.03個(gè)單位，顯示瘤胃pH變幅最大是0.165個(gè)單位。與精粗比不同引發(fā)瘤胃酸中毒后的瘤胃pH變異相比，這個(gè)變幅差異很小，不足以根本改變瘤胃發(fā)酵狀態(tài)。

本試驗(yàn)中兩組山羊的瘤胃pH僅有微小差異，處于正常范圍，說明低水平DCAD飼糧未對(duì)瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生負(fù)面影響。更進(jìn)一步，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)pH(飼喂低DCAD飼糧，DCAD=-111)、體外pH(以低DCAD飼糧作發(fā)酵底物，DCAD=-170)水平均在正常范圍[25]。與此類似，李斌[26]發(fā)現(xiàn)飼喂低DCAD飼糧后pH在2～6 h短期內(nèi)降低，但很快回升至正常水平，這可能與瘤胃液強(qiáng)大的緩沖能力有關(guān)；Murphy和Kennelly[27]也得出相同結(jié)論，他們指出瘤胃pH一般是在采食后2～6 h內(nèi)降低。Tucker等[28]對(duì)泌乳奶牛研究結(jié)果顯示，瘤胃pH水平隨飼糧DCAD水平升高(-100、0、100、200)而呈現(xiàn)上升趨勢，但瘤胃發(fā)酵模式未改變。張躍文等[29]在體外模擬瘤胃發(fā)酵試驗(yàn)中，飼糧DCAD水平由正值+120降為-150的幾個(gè)梯度(梯度水平為-70)對(duì)瘤胃pH均未產(chǎn)生影響。上述結(jié)果表明，DCAD水平造成的瘤胃pH差異很小，對(duì)瘤胃發(fā)酵狀態(tài)的影響可忽略不計(jì)，為研究后續(xù)發(fā)酵參數(shù)奠定了基礎(chǔ)。

3.3.2 瘤胃發(fā)酵參數(shù) 瘤胃NH3-N水平是反映飼糧蛋白質(zhì)在瘤胃中的降解、能量供給及微生物蛋白的合成的重要指標(biāo)，主要受采食速度、飼糧含氮量、降解速度、唾液及瘤胃緩沖能力等因素的影響。瘤胃微生物合成MCP所需的NH3-N水平在0.35～29.0 mg/100 mL之間[30]。當(dāng)飼糧含氮化合物的含量較大且易被降解，瘤胃降解速度大于瘤胃微生物的合成速度時(shí)，瘤胃內(nèi)NH3-N濃度較高，此時(shí)瘤胃中NH3-N參與“瘤胃-肝臟的氮素循環(huán)”。本試驗(yàn)結(jié)果表明，處理組和對(duì)照組NH3-N水平均處于正常范圍內(nèi)。胡明等[31]研究發(fā)現(xiàn)，隨飼糧DCAD水平增加(0、100、200、400)，瘤胃NH3-N變化范圍為4.60～31.62 mg/100 mL。馮強(qiáng)等[32]將飼糧DCAD水平設(shè)為0、50、100、200，發(fā)現(xiàn)在同一時(shí)間點(diǎn)，隨DCAD水平增加，瘤胃NH3-N濃度變化范圍為7.72～30.80 mg/100 mL之內(nèi)。這從另一側(cè)面說明，DCAD水平不對(duì)瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生負(fù)面作用。

瘤胃發(fā)酵作為反芻動(dòng)物營養(yǎng)研究的重要內(nèi)容，綜合本試驗(yàn)上述指標(biāo)測定結(jié)果和前人報(bào)道，可以認(rèn)為，DCAD水平不會(huì)對(duì)瘤胃發(fā)酵和體內(nèi)代謝產(chǎn)生負(fù)面影響。這為生產(chǎn)實(shí)踐中推廣添加陰離子鹽降低DCAD防治低血鈣提供了理論依據(jù)。

3.4 不同DCAD水平對(duì)山羊血漿指標(biāo)的影響

3.4.1 血漿Ca2+水平 作為降低DCAD處理的主要觀察點(diǎn)和效應(yīng)表征，血鈣水平是該類研究的重要檢測指標(biāo)。動(dòng)物血鈣穩(wěn)恒由胃腸道Ca2+攝取、骨鈣溶解及腎Ca2+重吸收等多種機(jī)制共同調(diào)節(jié)，一般維持在2.0～3.0 mmol/L范圍間；低于2.0 mmol/L，即發(fā)生低血鈣。本課題組前期研究報(bào)道，DCAD與血鈣水平存在較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)度，DCAD降低，血鈣水平升高；反之亦然[33]。這也在本試驗(yàn)中得到體現(xiàn)，并與該領(lǐng)域相關(guān)研究結(jié)果一致。Goff等[34]認(rèn)為，不考慮飼糧鈣水平的影響，飼糧 DCAD 為負(fù)值時(shí)，奶牛分娩時(shí)血漿中鈣離子的濃度顯著提高。Oba等[35]發(fā)現(xiàn)，對(duì)非泌乳非懷孕奶牛注射EDTA使其血鈣降低后，飼喂不同DCAD水平(-64 vs. 82)和不同的鈣水平(3.0和9.1 g/kg DM)飼糧，發(fā)現(xiàn)高鈣飼糧和低DCAD水平飼糧均能縮短血鈣水平恢復(fù)時(shí)間。總之，降低DCAD能提高血鈣水平，得到學(xué)界的普遍認(rèn)同，成為防治低血鈣的常用措施。

3.4.2 鈣調(diào)蛋白 PTH濃度是血鈣調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素，一方面可促進(jìn)腎臟對(duì)1,25-(OH)2VD3合成與分泌，二者可影響腎臟對(duì)Ca2+的重吸收；另一方面，PTH促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，抑制成骨細(xì)胞生成與轉(zhuǎn)化，調(diào)控骨骼鈣動(dòng)員。1,25-(OH)2VD3是Ca2+主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的載體，可促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞對(duì)Ca2+的主動(dòng)吸收。CT主要是抑制新的破骨細(xì)胞生成并使破骨細(xì)胞活性降低，從而降低血鈣濃度。上述3種激素濃度的變化可反映血鈣含量的變化。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然兩組山羊1,25-(OH)2VD3和CT水平變化不大，差異不顯著；但處理組血漿PTH濃度顯著高于對(duì)照組，這說明DCAD飼糧可促進(jìn)PTH的分泌，可能貢獻(xiàn)了較高的血鈣水平。VDR是鈣吸收過程中主要的調(diào)控因子，其與1,25-(OH)2VD3特異性結(jié)合為蛋白-受體復(fù)合物發(fā)揮生理功能[36]，同時(shí)，1,25-(OH)2VD3能有效提高胃腸道TRPV6的活性[37]。TRPV6大量分布于腸道上皮細(xì)胞，是促使胞內(nèi)Ca2+跨質(zhì)膜外排進(jìn)入血液的重要生理大分子，也是腸道上皮細(xì)胞對(duì)Ca2+的吸收的初始元件；在Ca2+吸收過程中，TRPV6通道表達(dá)增加，使Ca2+內(nèi)流速度加快、胞內(nèi)Ca2+濃度增加。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，低DCAD飼糧可提高山羊胃腸道VDR和血漿TRPV6的水平[38]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，山羊血漿VDR、TRPV6的濃度隨飼糧DCAD水平的降低而升高，并達(dá)到差異顯著水平，提示DCAD飼糧對(duì)血漿VDR、TRPV6的濃度有上調(diào)作用?？傮w來看，降低DCAD后，雖然并非所有鈣調(diào)因子濃度都增加，但血液PTH、VDR和TRPV6水平得以升高，使處理組山羊血鈣水平高于對(duì)照組，更好地維持血鈣穩(wěn)恒狀態(tài)。

4 結(jié) 論

低DCAD飼糧可降低山羊體內(nèi)酸堿平衡狀態(tài)，提高血鈣及其代謝因子水平，對(duì)瘤胃發(fā)酵指標(biāo)不產(chǎn)生負(fù)面影響。這為生產(chǎn)實(shí)踐推廣添加陰離子鹽降低DCAD防治低血鈣提供了理論依據(jù)。