謝斌云 ，劉媛 ，張偉 ，劉洋

（江西省南昌市第一醫(yī)院，1.創(chuàng)傷急救中心EICU；2.兒科NICU；南昌大學第一附屬醫(yī)院，3.呼吸內科；4.檢驗中心，南昌330000）

肺炎克雷伯菌 （Klebsiella pneumoniae，KP)是臨床常見腸桿菌科細菌之一依據(jù)細菌毒力和致病特點，可將肺炎克雷伯菌分為普通肺炎克雷伯菌(classic Klebsiella pneumoniae，cKP）和高毒力肺炎克雷伯菌 （hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKP)。hvKP侵襲的宿主大部分為年輕健康的患者，且容易并發(fā)膿毒血癥，導致壞死性筋膜炎、骨髓炎、化膿性肝膿腫、眼內炎等嚴重的侵襲性疾病[1]。同時多臟器感染也因其可繼發(fā)遷徙性播散而存在，臨床致殘率及致死率高，預后差，近年來一直成為研究的熱點[2]。隨著頭孢類抗生素的大量應用及濫用，產超廣譜β-內酰胺酶（ESBL）也相繼出現(xiàn)增多的情況，導致產ESBL的耐藥菌譜出現(xiàn)交叉耐藥問題。細菌耐藥引發(fā)的醫(yī)院感染爆發(fā)流行，感染性疾病治療效果不佳，住院費用高，治療時間長，嚴重影響了人類健康，已經成為21世紀我們不得不面臨的公共衛(wèi)生問題。而集毒力高、耐藥性強于一身的產ESBL高毒力肺炎克雷伯菌或將成為下一個“超級細菌”。本研究對南昌大學第一附屬醫(yī)院2016年6月-2017年12月分離的產ESBL高毒力肺炎克雷伯菌進行分析，探討耐藥機制及分子流行病學等，旨在為抗感染治療合理選用抗生素，預防和控制產ESBL耐藥菌的出現(xiàn)和播散，研制新型、高效的β-內酰胺類抗生素以及流行病學研究提供實驗依據(jù)和指導。

1 材料與方法

1.1 一般材料 收集2016年6月-2017年12月南昌大學一附醫(yī)院就診患者分離的KP，若同一位患者多次分離出相同的菌株，只留取首次分離的菌株為標準。采用VITEK-2生物分析儀自動鑒定菌株和藥敏試驗。使用拉絲試驗確定高黏液表型特征，使用紙片法試驗確認ESBL表型。按l:1的比例各收集產ESBL酶hvKP、非產ESBL酶hvKP感染的患者的病歷資料，將上述45例產ESBL酶hvKP感染的患者記為病例組A組。對照組B組為隨機抽取的45例非產ESBL酶hvKP感染的患者。質控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC700603和大腸埃希菌ATCC25922，均購買于衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2 黏液絲試驗 將細菌接種在5%綿羊血平板上，37℃培養(yǎng)16h后，用細菌接種環(huán)輕柔向上挑起平板上的肺炎克雷伯菌菌落，重復牽拉兩次或兩次以上，如果挑起的黏液絲長度大于或等于5 mm，判為黏液絲試驗陽性，反之則結果判讀為黏液絲試驗陰性。

1.3 產ESBL肺炎克雷伯菌進行表型確證試驗 推薦的紙片進行ESBL確證試驗，選取對三代頭孢菌素(頭孢曲松、頭孢噻肟)耐藥作為ESBL初篩標準，并記錄 ESBL陽性菌株分離率。將受試菌配成 0.5麥氏濁度菌液，用無菌棉棒挑取涂于MH瓊脂上，貼上頭孢他啶，頭孢他啶/克拉維酸，頭孢噻肟，頭孢噻肟/克拉維酸紙片在有待測菌的瓊脂培養(yǎng)基上，置于 35℃，16-18h后觀察結果，兩組中任何一組藥物，加克拉維酸與不加克拉維酸的抑菌圈相比，增加5 mm以上者，即判斷為ESBL菌株。

1.4 藥敏試驗 采用Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)檢測，采用紙片擴散法測定試驗菌株對抗菌藥物的敏感性，抗菌藥物紙片分別為：頭孢噻肟(CTX)、頭孢吡肟（FEP）、頭孢西?。‵OX）、亞胺培南（IPM）、頭孢他啶（CAZ）、氨曲南（ATM）、美羅培南（MEM）和厄他培南（ERT）及ESBL表型鑒定紙片頭孢噻肟／克拉維酸(CTX/CA)、頭孢他啶/克拉維酸（CAZ/CA）。參照CLSI標準進行實驗操作和結果判斷。

1.5 模板提取及PCR擴增條件 使用煮沸法提取臨床各種標本中分離出的肺炎克雷伯菌菌株DNA，PCR 的反應體系為 25μl： 正反引物各 0.5μl，DNA模板 3μl，mix 反應液 12.5μl，加蒸餾水使反應總體積為25μl，用無菌去離子水作為陰性對照。反應條件 ： 預 變 性 95℃ 5min；95℃ 45s，56℃ 90s，72℃90s，30 個循環(huán)；延伸 72℃ 10min。

1.6 產ESBL的高毒力肺炎克雷伯菌PCR鑒定將得到的PCR模板 （高毒力肺炎克雷伯菌DNA）進行擴增，12.5μl擴增體系：Taq Mix：6.25μl， 上游引物：0.25μl，下游引物：0.25μl，模板：1.5μl，ddH20：4.25μl；PCR 的反應條件：95℃預變性 5min，后 94℃變性 40s，52℃退火復性 30s，72℃延伸 1min 進行30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。移液槍吸取6.5μlPCR擴增產物后加入1%瓊脂糖凝膠上樣孔中，120 V，電泳25 min，電泳液為 1×TAE緩沖液，電泳結束后在凝膠成像儀上觀察結果，記錄結果。

1.7多位點序列分析 (MLST)引物設計與合成：從PUBMLST 網(wǎng)站（http://pubmlst.org/koxytoca/info/K_oxytoca_primers.pdf）上查詢肺炎克雷伯菌多位點序列分型7對管家基因，引物參照相關文獻[3]，引物由上海生工公司合成。

1.8 脈沖場凝膠電泳 （PFGE）用低熔點瓊脂糖包埋細菌，做成瓊脂糖膠塊；用細胞裂解液和蛋白酶K消化，使得 DNA被釋放到細胞外；大片段的DNA用限制性內切酶消化；制備好的樣品按照設計好的程序電泳；電泳的結果通過染色后被讀取，通過相關軟件進行數(shù)據(jù)的分析。

2 結果

2.1 藥敏實驗結果 結果顯示：所有菌株對氨芐西林天然耐藥，產ESBL酶hvKP菌對頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢西丁、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、厄他培南、亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨芐西林/舒巴坦的耐藥率顯著高于不產ESBL酶hvKP菌株(P＜0.05)，然而在阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素的耐藥率上差異無顯著意義 （P＞0.05），見表 1。

表1 產ESBL hvKP菌株和非產ESBL hvKP菌株對抗菌藥物的耐藥率的比較

2.2 ESBL的高毒力肺炎克雷伯菌普通PCR鑒定結果 從臨床分離的1263株肺炎克雷伯菌中篩出高毒力肺炎克雷伯菌株124株，其中K1莢膜血清型陽性85株，K2莢膜血清型陽性39株。在124株高毒力肺炎克雷伯菌中，表型試驗顯示45株為ESBL陽性hvKP菌株，79株為ESBL陰性hvKP菌株。經過表型試驗確定出的產ESBL高毒力肺炎克雷伯菌株45株均攜帶ESBL基因，其中 blaTEM基因陽性22株，占48.9%；blaSHV基因陽性13株，占28.9%，其中7株為blaSHV-1型，6株為blaSHV-12型，其中一株同時攜帶blaSHV-1型和blaSHV-12型ESBL基因。bla CTX‐M基因陽性10株，占22.2%，見表 2。

表2 產ESBL高毒力肺炎克雷伯菌PCR擴增相關基因引物

此外，我們還發(fā)現(xiàn)部分ESBL相關基因可共存于同一菌株中，如表2.5所示，我們發(fā)現(xiàn)blaCTXM-1和blaTEM共存于一株K1型菌株中，另外還發(fā) 現(xiàn) blaSHV-12+blaCTX-M-2、blaCTX-M-8+blaSHV-1+blaTEM、blaCTX-M-2+blaSHV-1+blaTEM、blaCTX-M-9+blaSHV-12+blaTEM、blaCTX-M-2+blaSHV-1+blaSHV-12共存的菌株各一株，且均為K2莢膜血清分型，這或表明K2型hvKP菌在獲得性耐藥上更具優(yōu)勢。

2.3 MLST分型結果 產ESBL酶hvKP菌株共45株，其中K1莢膜血清型陽性28株，K2莢膜血清型陽性17株。K1莢膜血清型陽性菌株均為ST23型，而17株K2型產ESBL酶hvKP菌株中10株為ST65型，5株ST86型，2株ST14型。而攜帶ESBL基因的產ESBL酶hvKP則主要為ST23型、ST65型，見表3。

表3 ESBL陽性hvKP菌株ESBL相關基因的基因型分布

2.4 PFGE結果 45株產ESBL酶hvKP菌株經PFGE得到電泳圖譜。將具有85%以上相同條帶（相關系數(shù)＞0.85）的菌株歸入同一帶型，45株產ESBL酶hvKP菌株被分為6個型別：A型[71.1%（32/45）]、C 型[20.0%（9/45）]，B 型、D 型、E 型、F 型各1株。A型、C型為主要型別。其中A型進一步分為 3個亞型，A1型 [31.1%（14/45）]、A2型[35.6%（16/45）]A3 型[4.5%（2/39）]。

3 討論

肺炎克雷伯菌 （Klebsiella pneumoniae，KP)廣泛存在于自然界及機體中。人體的皮膚、呼吸道和消化道等部位均寄存著該細菌，當人體抵抗力下降時，免疫力低下，常引起機體出現(xiàn)多種感染，如肺炎、肝膿腫、敗血癥等等。在血瓊脂平板上生長，hvKP菌株可表現(xiàn)出高黏液性，研究[4-6]發(fā)現(xiàn)，hvKP表現(xiàn)為高毒力主要是攜帶有黏液表型調節(jié)基因和氣桿菌素。依據(jù)細菌抗原性不同以及莢膜多糖結構的異常，肺炎克雷伯菌可分為至少82個莢膜血清型[6]，其中，Kl、K2、K5、K20、K57 和 K54 血清型與人類及動物的各種侵襲性感染密切相關，為高毒力莢膜血清型肺炎克雷伯菌[7-9]。因新的抗生素的大量應用甚至濫用，耐藥問題也隨之凸現(xiàn)，產ESBLs是細菌產生多重耐藥的常見表型機制，具體耐藥根因可以從基因層面分析。這其中肺炎克雷伯菌是最常見的產ESBL菌株，常引起醫(yī)院感染暴發(fā)流行，給醫(yī)院管理及疾病診治帶來非常棘手的困難?，F(xiàn)階段，無論是人類還是動物界，抗生素的使用過于頻繁，抗生素耐藥性問題越發(fā)嚴重。特別是頭孢類抗生素的大量應用及濫用，產超廣譜β-內酰胺酶（ESBL）也相繼出現(xiàn)增多的情況，導致產ESBL的耐藥菌譜出現(xiàn)交叉耐藥問題。

高毒力肺炎克雷伯菌的出現(xiàn)給臨床感染帶來了新的挑戰(zhàn)，其改變了對經典肺炎克雷伯菌感染的診治及流行。然而高毒力肺炎克雷伯菌在體外常表現(xiàn)出對除了氨芐西林外的其他抗生素高度敏感，故仍對其有相應的治療對策[10]。但隨著耐藥的廣泛流行，尤其是在各種抗生素濫用的情況下，抗生素耐藥已經成為影響臨床感染治療效果的重要因素。而此時，高毒力肺炎克雷伯菌也無法幸免。超廣譜β內酰胺酶是腸桿菌科細菌最常見的β內酰胺酶，其常常是導致腸桿菌科細菌β內酰胺類抗生素耐藥的重要原因。超廣譜β內酰胺酶根據(jù)同源性可分為TEM型、SHV型和CTX-M型等，其中前兩型最多見，世界范圍流行，我國以CTX-M型為主，而在本試驗中，我們卻發(fā)現(xiàn)hvKP菌株中主要為TEM和SHV型ESBL，這與以往的經典肺炎克雷伯菌報道不一致，或許與高毒力肺炎克雷伯菌獨特的耐藥發(fā)展特點有關。此外我們還發(fā)現(xiàn)hvKP菌株中同常常存在多種β內酰胺酶共存的情況，且多集中在K2型高毒力肺炎克雷伯菌中，這或許與K2型菌株的毒力相對較低有關[11]，這也表明K2型高毒力肺炎克雷伯菌或將成為高毒力肺炎克雷伯菌發(fā)展多重耐藥的重要突破口，也為我們監(jiān)測高毒力高耐藥肺炎克雷伯菌形成和發(fā)展提供了重要依據(jù)。由此可見，產ESBL酶的hvKP菌株的出現(xiàn)或給我們敲響了對高毒力肺炎克雷伯菌濫用抗生素治療警鐘，其中部分ESBL基因可通過質粒介導傳播、且集中在流行的克隆株上，也給我們的院感控制敲響了警鐘。加強對產ESBL酶hvKP菌株監(jiān)測及相關研究，為未來控制高毒力高耐藥肺炎克雷伯菌這一“超級細菌”的傳播提供理論依據(jù)。

與之前的研究文獻觀點有一致性[12-15]，本研究中K1血清學肺炎克雷伯菌的MLST分型主要以ST23型為主，K2血清學肺炎克雷伯菌主要以ST65型為主，在分子流行病學上，我們也發(fā)現(xiàn)雖然hvKP菌株的流行相對集中，以MLST分型結果看，K1型hvKP菌株主要集中在ST23型，但也存在少部分ST700型。相反，K2型hvKP菌株則略顯多態(tài)性，主要包括ST65型、ST86型及ST14型。而在耐藥基因攜帶上，我們發(fā)現(xiàn)所有ESBL基因陽性菌株主要集中在ST23型、ST65型及ST14型。本研究結果顯示本院分離出的產ESBL酶hvKP菌株的PFGE帶型相似性表現(xiàn)的比較明顯，提示本院各科室間產ESBL酶hvKP菌株或存在同類細菌的相關性傳播，鑒于此類現(xiàn)象，加強醫(yī)院感染預防措施和嚴格控制感染源及切斷傳播途徑意義重大，按無菌操作流程、接觸感染患者前后加強手衛(wèi)生、強化消毒隔離制度等等措施應嚴格執(zhí)行，最終將醫(yī)院感染的發(fā)生率降到最低。