王煒偉，李幸麗，錢峰*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理；2. 上海交通大學(xué)藥學(xué)院 細胞與治療抗體工程研究中心，上海 ）

0 引言

頭頸癌主要為頸部腫瘤、耳鼻咽喉腫瘤和口腔頜面部腫瘤，是發(fā)病率排在第六位、死亡率排在第八位的最常見癌癥[1]。臨床上，90% 的頭頸癌患者為頭頸鱗狀細胞癌。迄今為止發(fā)現(xiàn)煙草使用和酒精是導(dǎo)致頭頸癌的危險因素，并且它們具有協(xié)同效應(yīng)[2]。近年來，因為患者仍然經(jīng)常出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移和第二原發(fā)性腫瘤，即使結(jié)合放射治療、化療、外科手術(shù)以及免疫等手段，對于頭頸癌患者來說生存率并沒有明顯提高，其導(dǎo)致預(yù)后性差的很重要的原因之一就是腫瘤易形成轉(zhuǎn)移瘤。因此尋找開發(fā)新型天然抗腫瘤藥，誘導(dǎo)頭頸癌細胞死亡，抑制其遷移，對于頭頸癌的治療具有重要意義。

地膚子皂苷Ic 來源于藜科一年生草本植物地膚子Kochia scoparia (L.) Schrad 的果實。地膚子皂苷Ic 屬于齊墩果酸3-O-β-D-吡喃木糖(1 →3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷，是一種天然三萜皂苷[3]。目前研究應(yīng)用主要集中在其降糖，抗瘙癢、抗過敏，保護胃粘膜等功效方面，但是對于地膚子皂苷Ic 的抗腫瘤活性國內(nèi)外鮮有報道，因此，本研究主要是探討地膚子皂苷Ic 對于頭頸癌細胞HN30 遷移的影響，并進一步研究地膚子皂苷Ic 發(fā)揮抑制腫瘤遷移作用的分子機制，證明地膚子皂苷Ic 能夠有效抑制ERK 信號通路以及有效激活JNK 和p38MAPK 信號通路，同時上調(diào)p53 的表達，從而抑制頭頸癌細胞HN30 的遷移。

1 試劑與儀器

1.1 主要試劑

地 膚 子 皂 苷 Ic（C14H64O13;MW：764.93；純度＞98%）購自上海陶素生化技術(shù)有限科技公司。DMEM 培養(yǎng)基和100×青霉素/鏈霉素購自美國 Life technologies 公司，胎牛血清購自杭州天杭生物科技有限公司。抗體 p-p38MAPK，Total-p38MAPK，p-ERK，Total-ERK，p-JNK，Total-JNK，p53，β-actin 購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 主要儀器

Bio-Rad 凝 膠 成 像 儀（ChemiDoc MP）；顯 微鏡 (NIKONECLIPSETi-S,TS-100, 日 本 )；生 物 安 全柜（CLASS II BSC，ESCO 公司）；Centrifuge 5418R 離心機(Eppendorf,)；二氧化碳培養(yǎng)箱(BB15，Thermo Scientific 公司 )；微量移液槍 (Eppendorf, Gilson)；蛋白凝膠電泳儀(Bio-rad)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

人源HN30 癌細胞（購買自ATCC）用含 10% 胎牛血清、1 % 青霉素/ 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，37℃水浴快速復(fù)蘇細胞，將復(fù)蘇的細胞轉(zhuǎn)移到加有DMEM 完全培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm/3min 離心，后棄上清，用1mL 培養(yǎng)基將細胞沉淀重懸，移到加有培養(yǎng)基的皿中，并使細胞均勻分布于培養(yǎng)基中，將細胞置于 37℃，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)，及時進行換液及傳代，當細胞生長至對數(shù)生長期時，即可進行傳代、鋪孔及凍存。

2.2 劃痕試驗

實驗分組為DMSO 組和給藥組，給藥組設(shè)置藥物濃度分別為 0.3μM、1μM 和 3μM，首先將對數(shù)生長期的HN30 細胞以5×105個/mL 的濃度接種至12 孔板中，過夜培養(yǎng)。在每個孔中用槍頭劃個“十”字，棄培養(yǎng)基，用PBS 將不貼壁的細胞洗凈，加入無血清培養(yǎng)基，然后按照分組給藥后在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，鏡下觀察細胞愈合狀態(tài)，用 Image J 軟件對其進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計。

2.3 Western Blot 檢測蛋白表達

實驗分組為DMSO 組和給藥組，給藥組設(shè)置藥物濃度分別為 0.3μM、1μM 和 3μM，首先將對數(shù)生長期的HN30 細胞以5×105個/mL 的濃度接種至12 孔板中。按照實驗分組藥物孵育18 小時后，棄掉培養(yǎng)基，用適量 PBS 洗滌兩次，加入 100μLloadingbuffer（175mM/LTris-HCl，100mM/LDTT，7.5% 甘油，4.0%SDS 和 0.2%的溴酚藍溶于蒸餾水中），細胞充分裂解后用細胞刮收集樣品。樣品于恒溫混勻儀中，99℃下處理10 分鐘使蛋白變性。

取10μL 樣品上樣至SDS-PAGE 膠樣品孔中，電泳一定時間后轉(zhuǎn)膜70 分鐘，接著用5%的脫脂奶粉室溫下封閉2 小時，加入一抗4℃孵育過夜，用1×TNE緩沖液洗膜，每次7 分鐘，洗3 次，加入相應(yīng)的二抗，常溫下孵育 2 小時，TNE 緩沖液洗膜，每次 5 分鐘，洗 2 次，加入ECL 底物在凝膠成像儀顯影，顯影后將得到的目的條帶用ImageJ 軟件進行灰度值分析和統(tǒng)計。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗中所得數(shù)據(jù)均為至少 3 次獨立重復(fù)試驗的結(jié)果，并用平均值± 標準誤（mean±SEM）來表示，用 GraphPad Prim 5 軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，并使用one-way ANOVA，Newman-Keuls 法 檢 驗，P＜0.05 被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 地膚子皂苷Ic 抑制頭頸癌細胞HN30 細胞的遷移且具有劑量依賴性

遷移是腫瘤的一大特征，有效抑制腫瘤的遷移在治療腫瘤中具有很大意義，如圖所示，圖A 為化合物地膚子皂苷Ic 的化學(xué)結(jié)構(gòu)，圖B 是不同濃度的地膚子皂苷Ic 刺激HN30 細胞18 小時后，細胞愈合情況，圖C是細胞愈合能力的統(tǒng)計，從圖B 可以看出，相同條件處理下，18 小時后，在沒有藥物作用下，細胞愈合能力很強，在3μM 藥物作用下，愈合能力明顯減弱，圖C 統(tǒng)計圖可以看出隨著藥物濃度的增加，細胞愈合能力逐漸降低，說明其具有藥物依賴性。

圖1注: 地膚子皂苷 Ic 抑制HN30 頭頸癌細胞遷移，圖A 為地膚子皂苷Ic 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；圖B 為通過劃痕實驗證明地膚子皂苷Ic 抑制HN30 頭頸癌細胞的遷移；圖C 是通過劃痕實驗來測量傷口愈合率來反應(yīng)抑制細胞遷移的能力。其結(jié)果用平均值±標準誤（mean±SEM）來表示，三次獨立重復(fù)試驗，***P＜0.001 。

3.2 地膚子皂苷Ic 影響MAPK 信號通路的活化以及P53 的表達

MAPK 通路不僅在不同細胞的增殖、分化和基因表達中起關(guān)鍵作用，而且在腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移中也起重要作用[8-10]。通過蛋白免疫印跡法檢測，發(fā)現(xiàn)地膚子皂苷Ic 可以有效抑制ERK 的磷酸化，促進JNK 和p38MAPK 的磷酸化從而有效活化MAPKs 信號通路，從而抑制了頭頸癌細胞HN30 的遷移。

p53 基因是與腫瘤相關(guān)性較高的基因，當細胞中的DNA 損傷或細胞增殖異常時，p53 基因被激活，導(dǎo)致細胞周期停滯并啟動DNA 修復(fù)機制，使損傷的DNA 得以修復(fù)。然而，當DNA 損傷過度而無法被修復(fù)時，作為轉(zhuǎn)錄因子的p53 還可進一步激活下游促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細胞凋亡并殺死有DNA 損傷的細胞從而抑制腫瘤細胞的遷移[12-13]。通過蛋白免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，地膚子皂苷Ic 具有激活p53 的作用，并具有劑量依賴性，隨著地膚子皂苷Ic 的劑量的增加，p53 的表達量逐漸增高。

4 小結(jié)

地膚子皂苷Ic 是一種具有明確結(jié)構(gòu)且在植物中提取的天然化合物，有相關(guān)研究報道地膚子皂苷Ic 具有抗過敏、抗高血糖以及鎮(zhèn)痛抗炎作用[19-20]，可預(yù)防高脂血癥、高血壓、肥胖、動脈粥樣硬化等代謝綜合征[18]保護胃黏膜[3]等的生物學(xué)活性，也有少數(shù)對于其可以抗腫瘤的研究，有相關(guān)文獻報道地膚子皂苷Ic 可以有效抑制HepG2肝癌、前列腺癌的增殖促進其凋亡[4-7]，但是對地膚子皂苷Ic 是否抑制頭頸癌細胞HN30 的遷移尚不清楚。

圖2注：為確定地膚子皂苷 Ic 發(fā)揮抑制HN30 頭頸癌細胞遷移的作用機制，檢測一些關(guān)鍵蛋白的表達情況是非常重要的，在多次Western blot 檢測過程中，有一些變化明顯的蛋白。圖A 所示，用不同濃度的地膚子皂苷Ic（0、0.3、1 和3 μM）處理HN30 細胞18 小時后，收取蛋白樣品檢測蛋白表達，條帶顯示地膚子皂苷Ic 在1μM 濃度下p-ERK 發(fā)生了明顯的下降，而且可以預(yù)測的是藥物的劑量依賴性，藥物濃度逐漸增加，變化就更明顯了，p-JNK 和p-p38 MAPK 在0.3μM 的濃度下明顯上升，且具有劑量依賴性，隨著藥物劑量的增加，其蛋白含量逐漸增加，p53 在3μM 濃度下蛋白含量明顯增加，利用Image J 軟件對p-Erk (B)、p-Jnk(C)、p-p38 (D)、p-p53 (E) 的表達進行量化，其結(jié)果用平均值±標準誤（mean±SEM）來表示，三次獨立重復(fù)試驗，*P＜0.05,**P＜0.01, ***P＜0.001。

細胞增殖、生長、分化和代謝等調(diào)節(jié)失控導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。癌細胞極容易發(fā)生遷移與侵襲，形成轉(zhuǎn)移瘤，因此有效地抑制癌細胞的遷移與侵襲尤為重要[3]。有研究表明分別用芍藥苷和蒙花苷刺激腫瘤細胞，24 小時后明顯抑制腫瘤細胞遷移[21-22]；用雷公藤甲素刺激腫瘤細胞，12 小時后就可以顯著抑制腫瘤細胞的遷移[23]；在本研究中，我們以人源頭頸癌細胞HN30 作為體外腫瘤模型，通過用不同濃度的藥物對其進行刺激18 小時后發(fā)現(xiàn)，地膚子皂苷Ic 在1μM 的濃度下就能夠有效抑制腫瘤細胞的遷移，并且隨著藥物濃度的增加其抑制效果愈加明顯，因此，要想使藥物具有臨床使用的可能，開發(fā)具有有效劑量小，短時間就可有顯著作用，且毒性小等特點的藥物是目前藥物研究的重點。

MAPKs 信號通路在腫瘤細胞的生長和遷移中起著重要的作用，ERK 信號通路的激活，則會促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進腫瘤細胞的遷移[13]，例如雷公藤甲素通過抑制ERK 信號通路來抑制食管鱗癌的遷移[23]；JNK 和p38 MAPK 這兩種途徑調(diào)節(jié)細胞的生存與分化，激活這兩條途徑則會有效抑制腫瘤細胞的遷移[14-17]，例如芍藥苷通過激活p38MAPK 信號通路，抑制人乳腺癌MCF-7 細胞的遷移[22]，丹參酮II 通過JNK 信號轉(zhuǎn)到通路抑制人骨肉瘤的遷移[24]；在對于肝癌的研究發(fā)現(xiàn)，地膚子皂苷Ic 可以通過調(diào)節(jié)MAPKs 和PI3K/AKT 信號通路促進肝癌細胞的凋亡[7]；對于前列腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，地膚子皂苷Ic 可以作為一種新型的天然的SENP1 抑制劑有效地抑制前列腺癌的遷移[24]，在對于地膚子皂苷Ic 抑制頭頸癌細胞HN30 遷移的作用機制的研究中，我們通過蛋白免疫印跡法檢測了MAPKs（包括 ERK、JNK 和 p38 MAPK）通路相關(guān)蛋白以及p53 的蛋白表達情況來研究地膚子皂苷Ic 抑制腫瘤遷移的可能的作用機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地膚子皂苷Ic 可以有效抑制ERK 的磷酸化水平以及激活JNK 和p38 MAPK 的磷酸化水平，同時亦可以提高p53 的表達水平。P53 作為抑癌基因受多種信號因子的調(diào)控，有文獻報道p38MAPK 信號通路可以上調(diào)p53,且有文獻報道p53 信號通路可以激活RECK，RECK 基因是近年來發(fā)現(xiàn)的新型MMP 抑制劑，可以在轉(zhuǎn)錄后水平抑制多種MMP 的表達，從而抑制腫瘤的遷移[26-27]，因此在地膚子皂苷Ic 抑制頭頸癌細胞HN30 的遷移研究中，極有可能是通過激活p38MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，上調(diào)p53，從而抑制了頭頸癌細胞HN30 的遷移，但此結(jié)論有待進一步進行試驗論證。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)地膚子皂苷Ic 能夠有效抑制頭頸癌細胞HN30 的遷移，地膚子皂苷Ic 抑制ERK 信號通路，同時激活JNK 和p38 MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，此外，地膚子皂苷Ic 激活抑癌基因p53，從而抑制頭頸癌細胞HN30 的遷移。本研究發(fā)現(xiàn)地膚子皂苷Ic 具有抗腫瘤活性，為開發(fā)此類抗腫瘤藥物提供了一定理論依據(jù)。