李泰球 蒙牧求 李兵 潘月梅

【摘 要】目的：建立豬腰豆藥材質(zhì)量控制的方法。方法：采用TLC法進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC法進(jìn)行定量分析，色譜柱為COSMOSIL5C18-PAQ，以甲醇-0.2%磷酸為流動(dòng)相梯度洗脫，柱溫為35 ℃，流速為0.8 mL/min。結(jié)果：薄層色譜特征斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)。刺芒柄花苷濃度范圍在0.001 8～0.014 1 mg·mL-1內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;線性回歸方程為Y=6.193×104X-0.65（r=0.999 9）;刺芒柄花素濃度范圍在0.001 3～0.010 0 mg·mL-1內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;回歸方程為Y=1.873×104X-0.521（r=0.999 8）;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收試驗(yàn)結(jié)果均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的要求。結(jié)論：TLC法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，HPLC法靈敏度高、操作方法簡(jiǎn)單，本研究可為豬腰豆藥材的進(jìn)一步開發(fā)研究及建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)參考。

【關(guān)鍵詞】豬腰豆;薄層色譜法;高效液相色譜法;含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674-0688（2020）03-0086-04

豬腰豆[Whitfordiodendron filipes（Dunn）Dunn]又名大莢藤、細(xì)?；萏啬?、白藤花、豬腰子。豬腰豆是豆科（Leguminosae）豬腰豆屬（Whitfordiodendron Elmer）植物[1-3]的藥用部位，主要分布于云南、廣西等地。豬腰豆可藥用、食用。在民間，豬腰豆一般被當(dāng)做補(bǔ)腎助陽(yáng)、清熱解毒的藥物，且其藤莖還被用來(lái)治療跌打損傷、祛風(fēng)補(bǔ)血、調(diào)理月經(jīng)，其花可食用[4]。劉玉嬌[5]對(duì)豬腰豆的有效成分及藥理作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明黃酮類化合物是豬腰豆藥材的主要有效成分之一，具有抗心血管疾病等多種活性[6]。

芒柄花黃素（Formononetin，F(xiàn)orm）又名刺芒柄花素，為黃酮類化合物，是一種富含黃芪側(cè)根的異黃酮類植物雌激素[7]。通過查閱文獻(xiàn)，眾多學(xué)者對(duì)刺芒柄花素的成分含量、藥理作用及對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行了研究。韋建華等人[8-9]從壯藥兩粵黃檀中提取分離得到芒炳花黃素。張華[10]采用了高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定芒炳花素的含量。韓明陽(yáng)等人[11]采用高效液相色譜波長(zhǎng)切同時(shí)測(cè)定康復(fù)春口服液中黃芪指標(biāo)性刺芒柄花素的成分。黃保勝等人[12]通過SphK1-SIP信號(hào)通路抑制大鼠局灶性腦缺血再灌注的影響，具有改善腦缺血，降低腦含水量，具有保護(hù)作用[13]。費(fèi)洪新等人[14]研究芒柄花黃素對(duì)阿爾茨海默病小鼠結(jié)構(gòu)的影響。董陳誠(chéng)等人[15]研究發(fā)現(xiàn)，芒柄花黃素能抑制人胃癌細(xì)胞系MKN-45的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。已有研究表明芒柄花黃素能抑制膀胱癌T24細(xì)胞和EJ細(xì)胞增殖、對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的增殖起顯著抑制作用[16]。王茹月等人[17]提出芒柄花黃素對(duì)乳腺、前列腺、膀胱、肺、子宮內(nèi)膜、卵巢對(duì)多種惡性腫瘤顯示出良好的抑制作用。在一定濃度范圍內(nèi)，芒柄花黃素對(duì)惡性腫瘤的抑制作用呈劑量-時(shí)間依賴性。但在某些實(shí)驗(yàn)中較低濃度芒柄花黃素對(duì)癌細(xì)胞抑制作用不明顯，甚至促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[18-19]。芒柄花黃素具有對(duì)機(jī)體損傷的保護(hù)作用、降低血清LDL膽固醇、改善骨密度、調(diào)節(jié)激素分泌等預(yù)防保健功效，對(duì)人體內(nèi)環(huán)境和穩(wěn)態(tài)起到良性調(diào)節(jié)，這可能是它發(fā)揮抗癌作用的重要機(jī)制之一。例如，芒柄花黃素能有效抑制雌激素依賴性子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中FOXA1和GATA-3蛋白的表達(dá)而使雌激素受體水平下降，改善體內(nèi)的內(nèi)分泌微環(huán)境，從而改善患者預(yù)后[20]。此外，芒柄花黃素的抗炎作用可以幫助機(jī)體清除代謝廢物，使機(jī)體處于良好的適于正常細(xì)胞代謝的環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)癌細(xì)胞的免疫力。

豬腰豆中所含的有效成分雖被報(bào)道有多種治療作用，但目前對(duì)其質(zhì)量控制還未形成系統(tǒng)性的標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)豬腰豆的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究幾乎空白。本實(shí)驗(yàn)對(duì)豬腰豆采用薄層色譜法進(jìn)行定性分析并采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，為更深入地對(duì)豬腰豆的品質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行探討，并期望在開發(fā)豬腰豆抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抑細(xì)菌、抗衰老等藥物中提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為豬腰豆的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)藥材、試劑與儀器

（1）實(shí)驗(yàn)藥材。豬腰豆采集于廣西南寧，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為豬腰豆（Whitfordiodendron filipes（Dunn）Dunn）的地上部分。

（2）實(shí)驗(yàn)試劑見表1。

（3）儀器設(shè)備見表2。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

（1）薄層鑒別。

（2）豬腰豆供試品溶液的制備。稱取藥材粗粉適量，過三號(hào)篩，取藥材粉末約6 g，置于具塞錐形瓶中，加入MeOH溶劑30 mL，超聲波提取30 min，濾過，濾液濃縮至1 mL即得。

（3）刺芒柄花素對(duì)照品溶液的制備。取刺芒柄花素對(duì)照品約1 mg，加入甲醇進(jìn)行溶解，即得對(duì)照品溶液。

（4）刺芒柄花苷對(duì)照品溶液的制備。取刺芒柄花苷對(duì)照品約1 mg，加入甲醇進(jìn)行溶解，即得對(duì)照品溶液。

（5）薄層色譜試驗(yàn)及結(jié)果。根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》四部通則0502試驗(yàn)，取硅膠G薄層板，105 ℃活化30 min后，吸取供試品溶液、刺芒柄花素對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液2～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷∶甲醇∶冰醋酸（20∶1∶4 d）為展開劑展開，展距為7 cm，取出，晾干。在紫外光燈（365 nm）下檢測(cè)。結(jié)果顯示刺芒柄花素對(duì)照品和豬腰豆供試品在相同的Rf值位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，分離度好、斑點(diǎn)清晰（如圖1所示）。

根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》四部通則0502試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液、刺芒柄花苷對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液2～5 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄層板上，以甲醇∶水∶冰醋酸（7∶1∶4 d）為展開劑展開，展距為7 cm，取出，晾干。在紫外光燈（365 nm）下檢測(cè)，結(jié)果顯示刺芒柄花苷對(duì)照品和豬腰豆供試品在相同的Rf值位置上顯示相同顏色斑點(diǎn)，分離度好、斑點(diǎn)清晰（如圖2所示）。

3 含量測(cè)定方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱：COSMOSIL5C18-PAQ色譜柱（250 mm×4.6 mm;5 μm）;流動(dòng)相：甲醇（C）～0.2% 磷酸水溶液（D）;梯度洗脫。流速：0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：雙波長(zhǎng)切換檢測(cè)（見表3）;柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取刺芒柄花苷對(duì)照品3.060 0 g，加甲醇定容至10 mL，得到刺芒柄花苷對(duì)照品濃度為0.306 0 mg/mL，精密稱取刺芒柄花素對(duì)照品1.150 0 g，加甲醇定容至5 mL，得到刺芒柄花素對(duì)照品濃度為0.230 0 mg/mL。精密取上述刺芒柄花苷對(duì)照品溶液20 μL定容到1.5 mL量瓶中，即得刺芒柄花苷濃度為0.004 mg/mL，精密取刺芒柄花素對(duì)照品溶液46 μL定容到1.5 mL量瓶中，即得刺芒柄花素濃度為0.007 mg/mL。取上述刺芒柄花苷、刺芒柄花素各1 mL等量混合，得混合對(duì)照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備

取藥材粗粉適量，三號(hào)篩過濾，取藥材粉末約6 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入60%甲醇30 mL，稱重，加熱回流提取2 h，濾過，冷卻后稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻并濾過。所得濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。

4 方法學(xué)考察

（1）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。分別精密吸取“3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品和“3.3”項(xiàng)下供試品各10 μL，按“3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果供試品溶液中待測(cè)成分色譜峰與對(duì)照品溶液色譜峰保留時(shí)間一致，并且可達(dá)到有效的分離，分離度均大于1.5，表明本方法專屬性良好。高效液相色譜圖如圖3所示。

（2）線性關(guān)系考察。分別精密吸取“3.2”項(xiàng)下對(duì)照品刺芒柄花素的質(zhì)量濃度依次為0.001 2 mg/mL、0.003 7 mg/mL、0.006 3 mg/mL、0.007 5 mg/mL、0.010 1 mg/mL，質(zhì)量濃度依次為0.001 8 mg/mL、0.005 3 mg/mL、0.008 8 mg/mL、0.106 0 mg/mL、0.101 4 mg/mL的刺芒柄花苷各10 μL按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得到刺芒柄花素和刺芒柄花苷的線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖4所示），結(jié)果見表4。

（3）精密度試驗(yàn)。取“3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 μL在“3.1”色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積結(jié)果見表5、表6。

（4）重復(fù)性試驗(yàn)。按“3.3”項(xiàng)下方法制備得到6份供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，按“3.1”色譜條件下檢測(cè)，計(jì)算峰面積結(jié)果見表7、表8。

（5）穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“3.3”項(xiàng)下方法制備得到供試品溶液，在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h分別進(jìn)樣10 μL，按“3.1”色譜條件下檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算刺芒柄花素、刺芒柄花苷結(jié)果見表9、表10，刺芒柄花素、刺芒柄花苷峰面積值RSD均小于3%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（6）加樣回收試驗(yàn)。取供試品6份，精密稱定，分別精密加入一定量的對(duì)照品，按“3.1”色譜條件下測(cè)定并記錄峰面積，計(jì)算各成分加樣回收率。結(jié)果見表11。

（7）樣品含量的測(cè)定。取供試品3份，按“3.3”項(xiàng)下制備得到供試品溶液，按“3.1”色譜條件下測(cè)定，計(jì)算樣品中刺芒柄花素、刺芒柄花苷的含量。結(jié)果見表12。

5 結(jié)論

本次課題對(duì)于豬腰豆的TLC鑒別方法專屬性強(qiáng)，可用于樣品的定性分析。HPLC含量測(cè)定方法學(xué)結(jié)果顯示，可用于樣品的定量分析。該方法測(cè)定結(jié)果有較高的準(zhǔn)確度，表明所建立的定性、定量分析方法可行，對(duì)豬腰豆的鑒定及質(zhì)量控制具有一定的指導(dǎo)意義和參考價(jià)值。

6 討論

（1）刺芒柄花素展開劑考察。分別考察了石油醚-乙酸乙酯等多種展開體系。通過以上摸索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，展開劑選用的體積比為二氯甲烷∶甲醇∶冰醋酸（20∶1∶4 d）時(shí)，斑點(diǎn)清晰、分離度好，Rf值為0.57。

（2）硅膠板的考察。分別考察了自鋪板和市售板，在相同的樣品、對(duì)照品及展開條件下，結(jié)果顯示，自鋪板斑點(diǎn)分離差，對(duì)照品Rf值為0.50，樣品Rf值為0.53;而市售板斑點(diǎn)分離較好，對(duì)照品及樣品Rf值為0.70，經(jīng)過對(duì)比，市售板點(diǎn)出的斑點(diǎn)較自鋪板好。

（3）顯色劑考察。黃酮類化合物顯色劑采用紫外線氨熏、1%三氯化鋁乙醇溶液，結(jié)果顯示紫外線氨熏顯示的斑點(diǎn)更清晰，分離度較好，無(wú)拖尾現(xiàn)象;而1%三氯化鋁乙醇液結(jié)果顯示斑點(diǎn)顏色不清晰，有拖尾現(xiàn)象，故選用紫外線氨熏做顯色劑。

（4）刺芒柄花苷展開劑考察。因刺芒柄花苷極性較大，分別考察了二氯甲烷-甲醇-冰醋酸等多種展開劑體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，展開劑選用甲醇∶水∶冰醋酸（7∶1∶4 d）時(shí)，斑點(diǎn)清晰，分離度較好。

（5）流動(dòng)相考察?？疾旒状?0.1%磷酸等流動(dòng)相，結(jié)果表明，以甲醇-0.2%磷酸作流動(dòng)相，基線平穩(wěn)，故確定流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸溶液。本實(shí)驗(yàn)考察60%、70%、80%不同濃度甲醇，加熱回流和超聲不同提取方式，結(jié)果顯示，60%濃度回流提取方法更理想，具有良好的分離度、基線較平穩(wěn)。

（6）柱溫考察。分別考察25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的柱溫，結(jié)果顯示，在35 ℃時(shí)，基線較平穩(wěn)，分離度較好。

（7）波長(zhǎng)考察。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種成分進(jìn)行了紫外-分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，刺芒柄花苷在230～258 nm處有最大吸收波長(zhǎng)。刺芒柄花素在236～248 nm處有最大吸收波長(zhǎng)。

參 考 文 獻(xiàn)

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