王姜琳， 孫 杰， 楊慧健， 王冰潔， 潘 芬， 張 泓

（1. 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040；2. 上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201800）

流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，Hi）是一種革蘭陰性桿菌，常寄居于人上呼吸道，為條件致病菌，也是兒童社區(qū)獲得性感染的主要致病菌。感染Hi的兒童占全部感染人群的20%[1-2]，在革蘭陰性桿菌所致的肺炎中位居第三[3]，可引起肺炎、支氣管炎、化膿性腦膜炎、血流感染和中耳炎等感染性疾病，嚴(yán)重威脅兒童的身體健康[4-5]。氨芐西林作為治療Hi的主要抗菌藥物，近年來耐藥率不斷上升。產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是Hi對氨芐西林耐藥的主要機(jī)制，不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶氨芐西林耐藥（beta-lactamase-negetive ampicillin-resistance strains，BLNAR）菌目前占耐藥株的8%～10%[6-7]，逐漸受到臨床關(guān)注，但其耐藥機(jī)制及分子流行病學(xué)特征目前尚不明確。本研究對117株Hi臨床分離株進(jìn)行耐藥性、氨芐西林耐藥機(jī)制及同源性分析，以期為臨床抗感染治療和控制耐藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

117株Hi菌株（剔除重復(fù)菌株）均分離自2018年4—6月上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院住院患兒各類臨床樣本，其中114株分離自痰液樣本，2株分離自鼻咽拭子樣本，1株分離自肺泡灌洗液樣本。所有菌株均接種于40%甘油肉湯菌種保存液，-80 ℃冰箱保存。

1.2 試劑與儀器

巧克力平板（上海科瑪嘉微生物有限公司），氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、克拉霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑、頭孢類、氯霉素、左氧氟沙星及美羅培南等抗菌藥物粉劑、硝酸噻吩試紙（英國Oxiod公司），WHB 96孔藥物敏感性試驗(yàn)微孔板（美國賽默飛世爾公司），引物合成、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增試劑盒及1 000 bp相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[生工生物工程（上海）有限公司]，Z480 PCR擴(kuò)增儀（瑞士羅氏公司），Gel DocXR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），測序由上海柏辰生物公司完成。

1.3 方法

1.3.1 Hi菌株復(fù)蘇及鑒定 將保存于-80 ℃的Hi菌株復(fù)蘇，分區(qū)劃線接種于巧克力平板，35℃、5%CO2條件下培養(yǎng)20～24 h，挑取巧克力平板上可疑菌落密集劃線于TSA平板上，并貼上V、X及V+X因子紙片，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)20～24 h。若出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象（即V、X因子周圍不生長，僅在V+X因子周圍生長）則鑒定為Hi。

1.3.2 體外藥物敏感性試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)，質(zhì)控菌株Hi （ATCC 49247），結(jié)果判讀參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S26文件。

1.3.3 氨芐西林耐藥Hi菌株β-內(nèi)酰胺酶檢測 用頭孢硝噻紙片刮取少許巧克力平板上耐氨芐西林Hi菌落，15 min內(nèi)觀察，若紙片變紅為β-內(nèi)酰胺酶陽性，反之為陰性。

1.3.4 氨芐西林耐藥Hi菌株DNA模板制備 采用煮沸法提取氨芐西林耐藥菌株DNA模板。挑取1接種環(huán)的Hi菌落，置于含有300 μL無菌0.9%氯化鈉溶液的無菌Eppendorf管中研磨均勻，100 ℃恒溫金屬浴中溫浴10 min，1 500×g離心機(jī)離心1 min，吸取上清液即為細(xì)菌DNA模板，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.5 氨芐西林耐藥HiTEM-1、ROB-1及ftsI基因PCR擴(kuò)增 （1）引物設(shè)計(jì)。依據(jù)文獻(xiàn)[6-7]與GeneBank數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)β-內(nèi)酰胺酶TEM-1、ROB-1基因及編碼青霉素結(jié)合蛋白3的ftsI基因引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，并經(jīng)過次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脫氧核苷酸純化。引物序列見表1。（2）PCR擴(kuò)增體系。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL：10 mmol/L dNTP 1 μL，10×buffer 5 μL，Mg+3 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模版5 μL，無菌去離子水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃ 30 s，56 ℃（以TEM-1為例，其余基因引物退火溫度見表1）30 s，72 ℃ 30 s循環(huán)30次；72 ℃延伸3 min。

1.3.6 瓊脂糖凝膠電泳 取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×LoadingBuffer混勻，上樣于2%瓊脂糖凝膠加樣槽中，同時留1個空孔加入5 μL 1 000 bp相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，恒壓100 V 30 min，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察擴(kuò)增條帶。

表1 TEM-1、ROB-1及ftsI基因引物序列

1.3.7ftsI基因測序 將PCR擴(kuò)增后的ftsI基因進(jìn)行測序，測序結(jié)果與Hi的RdKW20標(biāo)準(zhǔn)菌株的ftsI基因進(jìn)行Blast比對。

1.3.8 氨芐西林耐藥菌株多重PCR基因分型 （1）引物設(shè)計(jì)。依據(jù)參考文獻(xiàn)[8]與GeneBank數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)多重PCR基因引物，其中一對引物來自Hi特異具有長度多態(tài)性的染色體DNA片段Hinf，另一對引物來自外膜蛋白P1-Hamp。引物序列見表2。（2）多重PCR擴(kuò)增體系。10 mmol/L dNTP 1 μL，10×buffer 5 μL，Mg+7 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模版5 μL，無菌去離子水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃45 s，45 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s循環(huán)30次；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.5%凝膠電泳40 min，擴(kuò)增條帶通過GIS ID分析軟件進(jìn)行分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS V8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hi耐藥性分析

H i對復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥率最高（80.3%），對頭孢類、氯霉素、左氧氟沙星及美羅培南的敏感率均高于80%。見表3。

表2 Hinf及Hamp基因引物序列

表3 Hi對抗菌藥物的耐藥性

2.2 氨芐西林耐藥Hi菌株β-內(nèi)酰胺酶檢測及產(chǎn)酶基因檢測

66株氨芐西林耐藥Hi中有54株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，12株不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，β-內(nèi)酰胺酶檢出率為46.2%（54/117）。54株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶氨芐西林耐藥（beta-lactamase-positive ampicillin-resistance strains，BLPAR）菌產(chǎn)酶基因均為TEM-1基因，未檢出ROB-1基因，凝膠電泳圖見圖1。

2.3 BLNAR菌與BLPAR菌耐藥性分析

BLPAR菌株對9種抗菌藥物的耐藥率均高于BLNAR菌株，但2類耐藥菌株只對大環(huán)內(nèi)酯類與磺胺類抗菌藥物的耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對頭孢類和碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

圖1 TEM-1基因檢測結(jié)果

表4 BLPAR與BLNAR Hi菌株對抗菌藥物的耐藥率與敏感率

2.4 氨芐西林耐藥Hi菌株ftsI基因擴(kuò)增及測序

66株氨芐西林耐藥Hi均擴(kuò)增出ftsI基因，凝膠電泳圖見圖2。測序結(jié)果顯示BLPAR菌中有37株HiftsI基因發(fā)生氨基酸置換，突變率為68.5%（37/54），BLNAR菌中有9株ftsI基因發(fā)生氨基酸置換，突變率為75.0%（9/12）；依據(jù)不同氨基酸置換形式可將ftsI基因分為不同的基因型[9]，2種菌ftsI基因型均以Ⅲ型為主，且SSN序列盒附近均以Ser385Thr置換形式為主，BLPAR菌與BLNAR菌發(fā)生Asn526Lys置換合并Ser385Thr置換分別占51.4%（19/37）、77.8%（7/9）；BLPAR菌中有2株發(fā)生氨基酸置換，但不可分型，1株菌同時具有Ⅰ與Ⅱ型的氨基酸置換形式。37株ftsI基因突變BLPAR菌與9株ftsI基因突變BLNAR菌氨基酸置換形式見表5。

圖2 ftsI基因檢測結(jié)果

表5 BLPAR與BLANR菌不同氨基酸置換形式菌株數(shù)

2.5 氨芐西林耐藥Hi多重PCR分型結(jié)果

66株氨芐西林耐藥Hi通過多重PCR分型共分為a、b、c、d、e 5個型[8]。BLPAR菌5個型均有，BLNAR菌僅有a型和e型，不同分型均具有克隆傳播趨勢。2種菌均以a型為主，分別占63%（34/54）和75%（9/12）。凝膠電泳圖見圖3。

圖3 多重PCR分型結(jié)果

3 討論

Hi是一種條件致病菌，常寄居于人的上呼吸道，以1～10歲的兒童感染為主[10]，于2—5月及冬春季分離率最高[11]。本研究菌株分離自2018年4—6月（第二季度），患兒年齡均在10歲以內(nèi)，以患有支氣管肺炎為主，分離樣本以痰液為主，補(bǔ)充了秦惠宏等[6]對2016年第一季度141株Hi臨床分離株的相關(guān)研究。

氨芐西林作為β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物被用于治療由Hi引起的各種感染，但隨著其被廣泛使用，耐藥率也呈上升趨勢。我國2007—2014年CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，Hi對氨芐西林的耐藥率由30.1%[12]上升至41.8%[7]。Hi對氨芐西林耐藥的機(jī)制為產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，已知的β-內(nèi)酰胺酶基因型主要有TEM和ROB型[10]，其中以TEM-1型為主[13]。同時還存在其他耐藥機(jī)制。2007—2014年，我國BLNAR菌株由2.7%[12]上升至8.6%[7]。國外BLNAR菌株占Hi的22.8%～40.8%[14-15]，明顯高于我國，以日本尤為嚴(yán)重，可能是因地區(qū)不同而導(dǎo)致耐藥機(jī)制出現(xiàn)差異。本研究117株Hi中氨芐西林耐藥率為56.4%，β-內(nèi)酰胺酶檢出率為46.2%，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因均為TEM-1基因，提示產(chǎn)TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶仍是氨芐西林耐藥Hi的主要耐藥機(jī)制，β-內(nèi)酰胺酶陰性耐藥菌株檢出率為10.3%，與秦惠宏等[6]報道的相關(guān)數(shù)據(jù)（53.2%、44.7%、12.8%）基本一致，提示上海地區(qū)耐氨芐西林Hi檢出率及不同機(jī)制構(gòu)成比相對穩(wěn)定。Hi對復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥率最高，對氨芐西林-舒巴坦、克拉霉素有較高的耐藥率，對頭孢類、氯霉素、氟喹諾酮及碳青霉烯類藥物有較高的敏感率，可能與兒童用藥選擇性有關(guān)，對氨芐西林與磺胺類抗菌藥物的高耐藥率表明Hi菌株已經(jīng)不適合采用這2種抗菌藥物進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)治療。BLPAR菌株對抗菌藥物的耐藥率均高于BLNAR菌株，但2種菌只對大環(huán)內(nèi)酯類與磺胺類抗菌藥物的耐藥率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對頭孢類、碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可見BLPAR所致耐藥比BLNAR所致耐藥對抗菌藥物耐藥性的影響更為顯著。

既往研究發(fā)現(xiàn)，Hi的BLANR菌株耐藥機(jī)制可能與ftsI基因突變導(dǎo)致青霉素結(jié)合蛋白3與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的親和力下降有關(guān)。根據(jù)不同位點(diǎn)的氨基酸置換，UBUKATA等[9]根據(jù)ftsI基因測序結(jié)果將Hi分為Ⅰ型、Ⅱ型與Ⅲ型。有文獻(xiàn)報道BLNAR菌以Ⅱ型為主，并首次檢出了同時含有Met377Ile、Ser385Thr和Leu389Phe 3種氨基酸置換的BLNAR菌株[16]。秦惠宏等[6]發(fā)現(xiàn)我國上海地區(qū)HiftsI基因分型以Ⅲ型為主。表明不同時間、不同國家、不同地區(qū)可能會因用藥習(xí)慣不同而導(dǎo)致ftsI基因型不同。本研究結(jié)果顯示，54株BLPAR中有37株ftsI基因發(fā)生氨基酸置換，突變率為68.5%，表明BLPAR菌除產(chǎn)酶機(jī)制以外，也可能同時存在ftsI基因突變機(jī)制。這2種機(jī)制同時存在的BLPAR菌被稱為β-內(nèi)酰胺酶陽性阿莫西林-克拉維酸耐藥Hi。BLNAR菌中有9株ftsI基因發(fā)生氨基酸置換，突變率為75.0%（9/12），BLNAR菌中有3株菌未發(fā)生ftsI基因突變，提示可能存在著其他耐藥機(jī)制，如外排泵機(jī)制等。2種菌ftsI基因型均以Ⅲ型為主，與秦惠宏等[6]的研究結(jié)果一致，表明上海地區(qū)氨芐西林耐藥HiftsI基因型別相對穩(wěn)定。不同的ftsI基因型可能是由不同地區(qū)用藥習(xí)慣不同所致。本研究中ftsI基因氨基酸置換形式均以KTG基序附近發(fā)生Asn526Lys置換合并SSN基序附近發(fā)生Ser385Thr置換為主；BLPAR菌中有2株菌發(fā)生氨基酸置換，但不可分型，1株菌同時具有Ⅰ與Ⅱ型的氨基酸置換形式。此外，本研究檢出了同時含有Met377Ile、Ser385Thr和Leu389Phe 3種氨基酸置換的BLPAR菌株，值得關(guān)注。

多重PCR因基因分型能力與脈沖場凝膠電泳分型能力接近，且比脈沖場凝膠電泳分型方法簡便、快捷[17]，通常被用于對細(xì)菌進(jìn)行基因分型，從而判定菌株親緣關(guān)系，了解細(xì)菌的同源性及分子流行病學(xué)特點(diǎn)。本研究多重PCR結(jié)果表明，BLPAR菌分為a、b、c、d、e型，BLNAR菌分為a、e型，且均有克隆傳播趨勢；2種菌均以a型為主，表明氨芐西林耐藥Hi以a型為主，與姜敏等[17]的報道一致。不同分型與抗菌藥物耐藥性及不同氨芐西林耐藥機(jī)制并無明顯的相關(guān)性，但都存在克隆傳播趨勢。

綜上所述，Hi對氨芐西林與磺胺類抗菌藥物的高耐藥率使這2種抗菌藥物不適合用于Hi的常規(guī)用藥；氨芐西林耐藥Hi的耐藥機(jī)制以產(chǎn)TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶為主，不產(chǎn)酶的耐藥機(jī)制主要是由KTG基序附近發(fā)生Asn526Lys置換合并SSN基序附近發(fā)生Ser385Thr置換介導(dǎo)ftsI基因突變所致，部分產(chǎn)酶菌株可以同時存在ftsI基因突變，突變機(jī)制同不產(chǎn)酶耐藥株。2種耐藥菌ftsI基因型均以Ⅲ型為主；產(chǎn)酶耐藥株比不產(chǎn)酶耐藥株對抗菌藥物耐藥性的影響更為顯著；BLPAR菌與BLNAR菌均存在克隆傳播趨勢。本研究中分離出同時含有Met377Ile、Ser385Thr和Leu389Phe 3種氨基酸置換的BLPAR菌株，另有3株BLNAR未發(fā)生ftsI基因突變，可能存在著其他耐藥機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。密切觀察Hi耐藥性、氨芐西林耐藥機(jī)制及同源性，有助于臨床合理進(jìn)行抗感染治療和控制耐藥。