周彬彬 張慧敏 朱文烽 孫登學(xué) 崔孟軍 張俊 向超 朱軍旗 蔣正立

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）又稱為老年性癡呆癥，是一種以漸進(jìn)性記憶障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元丟失和 β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的沉積[1]。2018年9月國際AD協(xié)會報道，2018年全球大約有5 000多萬癡呆患者，其中2/3是AD患者，并預(yù)測到2050年，患者人數(shù)將增加3倍[2]，AD給患者及其家庭造成沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，AD的預(yù)防和治療成為當(dāng)下急需解決的醫(yī)療和社會問題。各國癡呆診療指南均推薦膽堿酯酶抑制劑作為一線治療藥物，而膽堿酯酶抑制劑也在臨床中使用最為廣泛，代表性藥物為多奈哌齊[3-4]。APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠是目前最常用的評價AD治療藥物藥效以及考察藥物作用機(jī)制的動物模型。在前期研究中，本實驗組選用9月齡APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)Morris水迷宮實驗、跳臺實驗初步證實多奈哌齊并不能有效改善該模型小鼠記憶功能[5]，因此本實驗將進(jìn)一步探討多奈哌齊未能有效改善APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠記憶功能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 9月齡雄性APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠80只、同齡野生型小鼠20只均購自南京大學(xué)模式動物研究所（合格證號：0022834，201400204），并于 SPF 級動物房飼養(yǎng)，光照時間為 8:00～20:00，室溫 20～26℃，濕度40%～70%。飼養(yǎng)期間小鼠自由進(jìn)食和飲水，手術(shù)前后單獨(dú)飼養(yǎng)。

1.2 實驗器材及試劑 顯微鏡（NIB900-FL）購自上海維翰光電科技有限公司；乙酰膽堿酯酶活性測定試劑盒（批號：20150109）購自南京建成生物工程研究所；Aβ42ELISA試劑盒（批號：1433908C）購自美國Life Technologies公司；全血、血清多元素檢測試劑盒（改進(jìn)型）購自北京博暉創(chuàng)新生物技術(shù)股份有限公司；6E10抗體（批號：08IC01727）購自上海Covance公司；多奈哌齊購自日本衛(wèi)才制藥公司，多奈哌齊溶液以蒸餾水為溶媒，現(xiàn)用現(xiàn)配，配制終濃度分別為0.1、0.3和0.6mg/ml，給藥劑量按小鼠每10g體重0.1ml給藥。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 將APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為轉(zhuǎn)基因小鼠對照組、轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊1mg/kg組、轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊3mg/kg組和轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊6mg/kg組，每組20只，并以20只同齡野生型小鼠作為野生型小鼠對照組。飼養(yǎng)期間小鼠自由進(jìn)食和飲水，手術(shù)前后單獨(dú)飼養(yǎng)。飼料購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK-（軍）2002-001。

1.3.2 給藥方式 轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊1mg/kg組、轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊3mg/kg組和轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊6mg/kg組灌胃給藥1次/d，每周連續(xù)5d，持續(xù)12周，直至實驗結(jié)束。轉(zhuǎn)基因小鼠對照組和野生型小鼠對照組灌胃給予等量飲用水。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠大腦皮層和海馬組織中乙酰膽堿酯酶活性比較 轉(zhuǎn)基因小鼠對照組與野生型小鼠對照組大腦皮層組織中乙酰膽堿酯酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊各劑量組大腦皮層組織中乙酰膽堿酯酶活性均明顯低于野生型小鼠對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。各組小鼠大腦海馬組織中乙酰膽堿酯酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 1。

2.2 各組小鼠大腦皮層和海馬組織中Aβ42含量比較

1.3.3 動物組織處理 行為學(xué)實驗結(jié)束后，干冰麻醉動物，依次剪開小鼠皮膚、胸腔，充分暴露心臟，剪開心包膜，剪開右心耳，從左心室方向快速輸注TBS溶液30ml至流出液變清。然后斷頭取腦，冰上分離皮層和海馬，-80℃冰箱保存。部分小鼠大腦放入4%多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定3h后轉(zhuǎn)入10%蔗糖溶液中過夜，第2天換至20%蔗糖溶液中，8h后移入30%蔗糖溶液中。OCT包埋，隨后進(jìn)行冰凍切片，厚度20μM，用作免疫組化染色。稱取皮層、海馬重量，按重量的5倍體積加入組織蛋白裂解液，175 000g 4℃離心30min，收取上清液分裝，進(jìn)行生化測定。

1.3.4 乙酰膽堿酯酶活性檢測 采用隨機(jī)數(shù)字表法每組選取5只小鼠皮層、海馬組織裂解上清液，使用乙酰膽堿酯酶活性測定試劑盒檢測小鼠腦組織乙酰膽堿脂酶活性，所有操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 Aβ42含量測定 使用1.3.4中選取的組織裂解上清液，采用ELISA法測定小鼠皮層和海馬Aβ42含量，所有操作步驟嚴(yán)格按照Aβ42ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6 金屬離子測定 使用1.3.4中選取的組織裂解上清液，參照全血、血清多元素檢測試劑盒說明書測定小鼠腦組織內(nèi)的鋅離子、鎂離子、鈣離子、銅離子含量。

1.3.7 免疫熒光法測定腦內(nèi)Aβ42淀粉樣斑塊沉積 將冰凍切片于PBS中室溫平衡15min，然后置于2mol/L鹽酸溶液中，37℃恒溫?fù)u床孵育30min，再于0.1mol/L硼酸溶液中孵育2次，每次5min，TBS漂洗；用10%封閉驢血清孵育60min，加入一抗，4℃孵育過夜，然后吸出一抗，TBS漂洗；加熒光標(biāo)記的二抗，37℃恒溫?fù)u床上孵育1h，TBS漂洗，將切片貼在載玻片上，蓋上蓋玻片封好。野生型小鼠對照組大腦皮層和海馬組織中幾乎檢測不到Aβ42，而轉(zhuǎn)基因小鼠對照組和轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊各劑量組大腦皮層和海馬組織中Aβ42含量均明顯高于野生型小鼠對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊各劑量組和轉(zhuǎn)基因小鼠對照組大腦皮層和海馬組織中Aβ42含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表 2。

表1 各組小鼠大腦皮層和海馬中組織乙酰膽堿酯酶活性比較（U/mgprot）

表2 各組小鼠大腦皮層和海馬組織中Aβ42含量比較（10-6mg/ml）

2.3 各組小鼠大腦皮層和海馬組織中金屬離子含量比較轉(zhuǎn)基因小鼠對照組和轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊各劑量組大腦皮層和海馬組織中鎂離子、鈣離子和銅離子含量均高于野生型小鼠對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊各劑量組和轉(zhuǎn)基因小鼠對照組大腦皮層和海馬組織中鎂離子、鈣離子和銅離子含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。各組小鼠大腦皮層和海馬組織中鋅離子比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 3。

2.4 Aβ42淀粉樣斑塊沉積的免疫熒光測定 12月齡APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層和海馬等區(qū)域均出現(xiàn)明顯的Aβ42淀粉樣斑塊沉積，但多奈哌齊長期給藥未顯著減少Aβ42淀粉樣斑塊沉積，見圖1（插頁）。

圖1 多奈哌齊對APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ42淀粉樣斑塊肽沉積的影響-免疫熒光圖（a:野生型小鼠對照組；b：轉(zhuǎn)基因小鼠對照組；c：轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊3mg/kg組；d:轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊6mg/kg組）

3 討論

AD是發(fā)生在中樞神經(jīng)的一種病因復(fù)雜的原發(fā)性神經(jīng)退行性疾病。由于AD的發(fā)病是多因素交叉引起的，其病理及生化的改變是多方面的，眾多的學(xué)者在研究過程中，形成了各自不同的假說，其中Aβ淀粉樣肽學(xué)說是目前大家對AD比較公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制[6]。近年來的在體內(nèi)和體外實驗發(fā)現(xiàn)，淀粉樣前體蛋白（APP）和其代謝的蛋白片段Aβ的形成與金屬離子的代謝紊亂有關(guān)[7-8]。鋅和銅參與了AD患者腦組織正常細(xì)胞蛋白的聚集和活性氧簇的產(chǎn)生，另外金屬離子還參與了AD的其他相關(guān)病理過程，如神經(jīng)元纖維纏結(jié)的形成、分泌酶清除APP過程和蛋白水解酶降解Aβ。

APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠是一種經(jīng)典的、國內(nèi)外較公認(rèn)的AD轉(zhuǎn)基因動物模型之一，此模型可穩(wěn)定表達(dá)突變的人類早老素1和APP融合體，引起細(xì)胞外淀粉樣蛋白的沉積[8]，其優(yōu)勢是將兩個易感基因結(jié)合在一起，從而縮短病理變化時間，并使病理特征多樣化，能夠較好地模擬AD患者的早期病理和行為特征[9]以及模擬AD患者膽堿能系統(tǒng)的改變。研究證明，AD患者大腦內(nèi)存在膽堿能系統(tǒng)的紊亂[10]。膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊是臨床常用的抗AD藥物，本研究以多奈哌齊為受試藥，考查了多奈哌齊抗AD的作用。在前期的行為學(xué)實驗中，實驗結(jié)果顯示APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠存在明顯的學(xué)習(xí)記憶能力缺失現(xiàn)象，但多奈哌齊對APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙無明顯改善作用，提示在此動物模型中多奈哌齊治療AD的作用沒有達(dá)到預(yù)期效果，因此本實驗旨在揭示多奈哌齊未能改善APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙功能的機(jī)制。本實驗結(jié)果顯示多奈哌齊可明顯降低APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層組織中乙酰膽堿酯酶活性，但多奈哌齊對小鼠海馬組織中乙酰膽堿酯酶活性卻并無影響；Aβ42含量檢測結(jié)果顯示野生型小鼠腦內(nèi)幾乎檢測不到Aβ42，轉(zhuǎn)基因小鼠對照組皮層和海馬組織中Aβ42含量明顯升高，但多奈哌齊長期給藥未能減少Aβ42淀粉樣斑塊沉積；金屬離子測定結(jié)果顯示，多奈哌齊長期給藥對轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層組織鎂離子、銅離子和鈣離子含量無明顯影響。

表3 各組小鼠大腦皮層和海馬組織中金屬離子含量比較

多奈哌齊是目前臨床上使用最廣泛的膽堿酯酶抑制劑之一，其主要作用通過增加腦內(nèi)乙酰膽堿水平而發(fā)揮學(xué)習(xí)記憶改善作用。在東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠癡呆模型上，多奈哌齊顯示了良好的學(xué)習(xí)記憶改善作用。但APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶缺失主要是由Aβ的毒性引起，多奈哌齊可能并不能通過此環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。本研究提示AD發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，其病理及生化的改變也是多方面的，因此不同的動物模型只能反映AD病理變化的某一方面，而對于AD治療藥物特別是新藥的藥效評價應(yīng)采用多種動物模型綜合評價。