郭小衛(wèi) 潘悅

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，最常見的病理類型為甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1]。當(dāng)前，我國甲狀腺癌的發(fā)病率和檢出率呈上升趨勢[2]。趨化因子受體3(chemokine receptor 3，CXCR3)、趨化因子配體 10(chemokine ligand 10，CXCL10)的相互作用與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系逐漸引起臨床重視[3]。CXCR3與CXCL10相互作用，一方面可通過激活免疫活性細(xì)胞或抑制相關(guān)血管生成來抑制腫瘤的生長；另一方面也可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，分泌蛋白水解酶，誘導(dǎo)血管生成來促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[3]?；诖?，本研究采用免疫組化法對PTC組織與癌旁正常組織中 CXCR3、CXCL10表達(dá)水平進(jìn)行檢測，并分析CXCR3、CXCL10表達(dá)與PTC患者臨床病理特征的關(guān)系，探討其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2018年1至8月在臺(tái)州市中心醫(yī)院行手術(shù)切除治療的79例PTC患者的腫瘤組織標(biāo)本及其相應(yīng)的癌旁正常組織（距離病灶2cm以上）。其中男37例，女42例；年齡20～72歲，中位年齡41歲。術(shù)前所有患者均未接受內(nèi)放療或外放療。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 非免疫性牛血清、兔超敏二步法免疫組化檢測試劑、DAB顯色試劑均購自福建邁新生物技術(shù)有限公司，CXCR3單克隆抗體和CXCL10單克隆抗體均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組化法檢測CXCR3、CXCL10的表達(dá) 采用SP法分別檢測PTC組織與癌旁正常組織中CXCR3、CXCL10的表達(dá)。組織標(biāo)本的石蠟玻片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度脫水，在體積分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫溶液中室溫孵育15min；浸入0.01mmol/L的枸櫞酸中，微波抗原修復(fù)；用體積分?jǐn)?shù)為10%的非免疫性牛血清封閉，分別加入CXCR3單克隆抗體、CXCL10單克隆抗體，在37℃溫箱中孵育1h；加入通用型免疫組化二抗，37℃孵育10min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS替代一抗作為陰性對照。

1.2.3 結(jié)果判定 細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色的顆粒視為CXCR3、CXCL10陽性染色。在高倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，按照染色細(xì)胞數(shù)目的多少及顯色深淺進(jìn)行評(píng)分[4]。（1）根據(jù)陽性細(xì)胞著色深淺計(jì)分：0分為不顯色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。（2）根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分：0分為陽性細(xì)胞比例＜15%，1分為陽性細(xì)胞比例15%～25%，2分為26%～75%，3分為≥76%。以兩項(xiàng)得分乘積評(píng)定結(jié)果，其中0分為陰性（-）；1～3分為弱陽性（+），4～6分為中陽性（++），7～9分為強(qiáng)陽性（+++）。+、++和+++視為陽性表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo) （1）觀察并比較PTC組織與癌旁正常組織中 CXCR3、CXCL10陽性表達(dá)率；（2）按照 2017年美國癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）關(guān)于PTC的TNM分期及患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無等情況分成亞組，分析PTC組織中CXCR3、CXCL10的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PTC組織與癌旁正常組織中CXCR3表達(dá)比較 PTC組織中CXCR3陽性表達(dá)率為69.6%（55/79），而癌旁正常組織中CXCR3陽性表達(dá)率為25.3%（20/79），PTC組織陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意見（P＜0.05）。PTC組織與癌旁正常組織中CXCR3表達(dá)顯微鏡下所見見圖1（插頁）。

圖1 PTC組織與癌旁正常組織中CXCR3表達(dá)顯微鏡下所見（a:CXCR3在PTC組織中陽性表達(dá)；b：CXCR3在PTC組織中陰性表達(dá)；c：CXCR3在癌旁正常組織中陽性對照；d：CXCR3在癌旁正常組織中陰性對照；免疫組化染色，×400）

2.2 PTC組織與癌旁正常組織中CXCL10表達(dá)比較PTC組織中CXCL10陽性表達(dá)為60.8%（48/79），癌旁正常組織中CXCL10陽性表達(dá)率為20.2%（16/79），PTC組織中陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意見（P＜0.05）。PTC組織與癌旁正常組織中CXCL10表達(dá)顯微鏡下所見見圖2（插頁）。

圖2 PTC組織與癌旁正常組織中CXCL10表達(dá)顯微鏡下所見（a:CXCL10在PTC組織中陽性表達(dá)；b：CXCL10在PTC組織中陰性表達(dá)；c：CXCL10在癌旁正常組織中陽性對照；d：CXCL10在癌旁正常組織中陰性對照；免疫組化染色，×400）

2.3 PTC組織中CXCR3、CXCL10的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 PTC組織中CXCR3、CXCL10的表達(dá)與患者TNM分期、腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)（均P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤最大徑均無關(guān)（均P ＞0.05）,見表 1。

2.4 PTC組織中CXCR3表達(dá)與CXCL10表達(dá)的關(guān)系PTC組織中CXCR3的表達(dá)與CXCL10的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.597，P＜0.05），見表 2。

3 討論

趨化因子是一類分泌性小分子蛋白，對不同靶細(xì)胞具有趨化和誘導(dǎo)功能，根據(jù)特征性保守半胱氨酸基序的排列不同，可分為C、CC、CXC及CX3C共4個(gè)亞家族[5]。CXCR3是CXC趨化因子亞家族的受體之一，屬于Th1細(xì)胞趨化因子受體。CXCR3基因定位于染色體Xq13，cDNA全長1104bp，相對分子質(zhì)量約為41 000，屬于G蛋白耦聯(lián)受體超家族，共編碼368個(gè)氨基酸[6]。CXCL10是CXCR3其中一個(gè)配體，是一種相對分子質(zhì)量小的結(jié)構(gòu)相關(guān)性蛋白，它通過與靶細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合引起靶細(xì)胞的定向遷移[7]。多項(xiàng)研究表明CXCR3及其特異性配體與腫瘤免疫和腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8-15]。

林明臻等[8]采用免疫組化SP方法檢測，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中的CXCR3表達(dá)陽性率為 90.0%（72/80），顯著高于乳腺纖維腺瘤組的10.0%（2/20）；王曉雅等[9]利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析CXCR家族蛋白在不同乳腺癌亞型中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CXCR3蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。Yang等[10]通過蛋白質(zhì)印跡法檢測，發(fā)現(xiàn)在人體胃癌組織及細(xì)胞系中，CXCR3 mRNA及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，這說明CXCR3在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)PTC組織中CXCR3高表達(dá)，在癌旁正常組織中CXCR3低表達(dá)，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明CXCR3可能是個(gè)潛在的促癌基因，與PTC的發(fā)生關(guān)系密切，或能作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，CXCL10在早孕絨毛、葡萄胎、葡萄胎惡變以及滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組中陽性表達(dá)率逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[11]。Utsumi等[12]采用免疫組化法檢測出腎癌組織中CXCL10的表達(dá)水平是正常腎組織的 22倍，CXCR3的表達(dá)水平是正常腎組織的6倍，提示CXCR3/CXCL10生物軸在腎癌侵襲、轉(zhuǎn)移中可能起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)PTC組織中CXCL10陽性表達(dá)率為60.8%，而癌旁正常組織中陽性表達(dá)率為20.2%，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示CXCL10可能也是個(gè)潛在促癌基因，它與CXCR3共同促進(jìn)了PTC發(fā)生、發(fā)展。

表1 PTC組織中CXCR3、CXCL10的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系分析[例（%）]

表2 PTC組織中CXCR3表達(dá)與CXCL10表達(dá)的關(guān)系分析[例（%）]

Ma等[13]在75例乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CXCR3的表達(dá)水平與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移累及的淋巴結(jié)數(shù)呈正相關(guān)。Murakami等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CXCR3高表達(dá)可促進(jìn)結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，敲除CXCR3后的結(jié)直腸癌腫瘤組織樣本發(fā)生淋巴結(jié)及器官(主要是肝和肺)轉(zhuǎn)移明顯減少。而王昌敏等[15]在胃癌中的研究發(fā)現(xiàn)CXCR3過表達(dá)與腫瘤侵襲遷移率呈負(fù)相關(guān)，與患者總生存率呈正相關(guān)。本研究進(jìn)一步分析了PTC組織中CXCR3、CXCL10蛋白的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PTC患者TNM分期病期偏晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的、腫瘤分化程度低的，PTC組織CXCR3、CXCL10表達(dá)陽性率均越高。這提示CXCR3、CXCL10在PTC中是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的不良指標(biāo)。

有研究指出乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)CXCR3、CXCL10的原因?yàn)槿橄侔┘?xì)胞能自分泌 CXCL10，且高表達(dá)的CXCL10能進(jìn)一步上調(diào)CXCR3的表達(dá)，這兩者相互作用又可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，從而進(jìn)一步導(dǎo)致CXCL10表達(dá)上調(diào)及CXCR3高表達(dá)[16]。本研究中Spearman相關(guān)分析顯示，PTC組織中CXCR3的表達(dá)與CXCL10的表達(dá)呈正相關(guān)，提示CXCL10作為CXCR3的配體，共同參與了PTC發(fā)生、發(fā)展的過程。

綜上所述，CXCR3在PTC組織中的異常高表達(dá)，可能通過其配體CXCL10來實(shí)現(xiàn)，但CXCR3是否還通過其他基因來調(diào)控PTC的細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，仍需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果提示CXCR3、CXCL10有可能作為PTC治療的新的潛在靶點(diǎn)。