蔣衛(wèi)平 蔣慧玲 史楊 程慧斐 張嵩韜 黃桂英 裴立紅 徐燕 趙志鋼 周麗紅

宮頸鱗狀細胞癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤。高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染是宮頸鱗狀細胞癌發(fā)生的主要原因，同時宿主因素也起著重要作用，即不同的群體和個體對宮頸鱗狀細胞癌的易感性存在差異。亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetraahydrofolate reductase，MTHFR）是葉酸代謝的關(guān)鍵限速酶，參與DNA的甲基化過程，大量研究表明，MTHFR基因多態(tài)性與宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展及預后關(guān)系密切。以往對浙江省麗水地區(qū)婦女HPV感染的流行病學調(diào)查顯示，患者最常見的高危型HPV為16、18、52和58型[1]。為此，筆者在麗水地區(qū)進行MTHFR基因多態(tài)性與HPV（16、18、52、58）感染者宮頸鱗狀細胞癌發(fā)病風險的關(guān)系研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年5月至2018年10月在麗水市中心醫(yī)院住院治療的高危型 HPV（16、18、52、58）感染宮頸鱗狀細胞癌患者115例為病例組，均經(jīng)組織病理學檢查證實為宮頸鱗狀細胞癌，經(jīng)HPV分型檢測為HPV 16、18、52、58型這 4個型別的單一或混合感染。另擇同期來麗水市中心醫(yī)院體檢的143例婦女為對照組，均未感染 HPV。病例組年齡 31～70（52.8±9.2）歲，對照組年齡 30～69（53.1±8.9）歲，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，受試者均為麗水市籍并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 所有受試者均采集宮頸分泌物和靜脈血。宮頸分泌物用專用細胞保存液保存，靜脈血用EDTA-K2抗凝。所有標本采集當天完成所有項目檢測。

1.2.2 HPV分型檢測 采用廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司產(chǎn)品，該試劑運用PCR-反向點雜交法，具體為針對HPV基因組晚期區(qū)L1區(qū)設計特異性引物和28型探針，并將特異性探針包被在尼龍膜上，再通過生物素標記的引物進行靶片斷擴增，PCR產(chǎn)物和膜條上的特異性探針雜交，通過雜交、洗膜，靶標中的型特異性片斷會和特異性探針結(jié)合，最后進行顯色和結(jié)果分析，從而檢測HPV 28種基因型DNA，包括15種高危型別：16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82（MM4）；3 種疑似高危型別：26，53，66；10 種低危型別：6，11，40，42，43，44，54，61，81（cp8304），83（MM7）。

1.2.3 MTHFR基因多態(tài)性檢測

1.2.3.1 核酸提取或純化 采用江蘇康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品，該試劑運用柱式提取法，具體為樣本經(jīng)蛋白酶K結(jié)合、裂解后，DNA特異性結(jié)合到Spin Columns柱上，污染物經(jīng)離心丟棄，PCR抑制劑可通過兩步有效的洗滌被完全去除，結(jié)合在離心柱上的核酸可用洗脫液洗脫，得到純化的DNA，基因組DNA要求：經(jīng)紫外分光光度計檢測吸光度（OD）值，OD260/OD280≥1.7，OD260/OD230≥1.5，純度 5～10ng/μl。

1.2.3.2 MTHRF多態(tài)性檢測 采用江西諾德醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品，該試劑運用實時熒光PCR技術(shù)進行檢測，針對MTHFR C677T、A1298C兩個位點設計引物和探針，在677-T和1298-A的探針上標記FAM熒光素，在677-C和1298-C的探針上標記VIC熒光素，通過實時熒光PCR分析其單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。

1.3 觀察指標 （1）MTHRF基因SNP位點信息。通過https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs1801133網(wǎng)站查詢。（2）病例組患者HPV分型分布情況。（3）兩組受試者MTHFR-C677T、MTHFR-C677T基因型和等位基因分布頻率。（4）分析MTHFR基因多態(tài)性與宮頸鱗狀細胞癌發(fā)病風險的關(guān)系。用比值比（OR值）來表示暴露因素與疾病間的關(guān)聯(lián)強度。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。采用Haploview4.2軟件進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。以非條件logistic回歸分析計算表示相對風險度的OR值及其95%CI。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTHRF基因SNP位點信息 通過https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs1801133網(wǎng)站查詢到：MTHFR中的rs1801133基因多態(tài)性位點，MTHFR中的677C＞T表示在第677個堿基位置中編碼丙氨酸（Ala）的密碼子GCC中的第2個堿基C突變成T形成編碼纈氨酸（Val）的密碼子GTC，編碼的氨基酸位置為第222個，表示為Ala222Val。同理，查詢到：MTHFR中的rs1801131基因多態(tài)性位點，1298A＞C表示第1 298個堿基位置中編碼谷氨酸（Glu）的密碼子GAA中的第2個堿基A突變成C形成編碼丙氨酸（Ala）的密碼子GCA，編碼的氨基酸位置為第429個，表示為Glu429Ala。

2.2 病例組患者HPV分型分布情況 病例組患者感染 HPV（16）70 例，占 60.8%；感染 HPV（18）11 例，占9.6%；感染 HPV（52）14例，占 12.2%；感染 HPV（58）20例，占17.4%。其中31例患者同時感染其他型別的HPV（至少包括16，18，52，58中的1種），占26.9%。

2.3 兩組受試者MTHFR-C677T、MTHFR-C677T基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗和比較 病例組和對照組MTHFR-C677T、MTHFR-A1298C基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（均P＞0.05）。病例組和對照組MTHFR-C677T、MTHFR-A1298C基因型頻率分布比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05），見表1～2。

2.4 MTHFR基因多態(tài)性與宮頸鱗狀細胞癌發(fā)病風險的關(guān)系分析 非條件logistic回歸分析顯示，MTHFR基因C677T多態(tài)性位點中，攜帶T的受試者HPV（16、18、52、58）感染宮頸鱗狀細胞癌發(fā)病風險是攜帶C的受試者的 1.871 倍（OR=1.871，95%CI：1.294～2.705，P＜0.05）；MTHFR基因A1298C多態(tài)性位點中，攜帶C的受試者HPV（16、18、52、58）感染宮頸鱗狀細胞癌發(fā)病風險是攜帶A 的受試者的 1.867 倍（OR=1.867，95%CI：1.204～2.896，P＜0.05），見表 3。

3 討論

MTHFR將5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-四氫葉酸，5-四氫葉酸作為輔因子在經(jīng)蛋氨酸合成酶的催化作用后生成蛋氨酸，蛋氨酸在腺苷轉(zhuǎn)移酶的作用下生成S-腺苷甲硫氨酸；MTHFR基因多態(tài)性是導致酶活性降低或缺失以及熱穩(wěn)定性改變的主要機制[2]。MTHFR基因位于1號染色體短臂上(1p36.3)，共有11個外顯子和10個內(nèi)含子；目前發(fā)現(xiàn)的MTHFR突變位點有近20多個，其中與人類疾病關(guān)系較為密切的是C677T和Al298C[3]。

本研究以麗水地區(qū)人群為研究對象，探討了MTHFR-C677T和MTHFR-A1298C基因多態(tài)性與HPV（16、18、52、58）感染的宮頸鱗狀細胞癌發(fā)病風險的關(guān)系，統(tǒng)計學分析表明兩組樣本兩個基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡，表明研究對象具有群體代表性，分別代表了麗水地區(qū)HPV陰性的健康婦女和感染HPV（16、18、52、58）的宮頸鱗狀細胞癌患者。通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，MTHFR-C677T多態(tài)性位點中，攜帶T的受試者HPV（16、18、52、58）感染宮頸鱗狀細胞癌發(fā)病風險是攜帶C的受試者的1.871倍；MTHFR-A1298C多態(tài)性位點中，攜帶 C 的受試者 HPV（16、18、52、58）感染宮頸鱗狀細胞癌發(fā)病風險是攜帶A的受試者的1.867倍。

表1 MTHFR-C677T基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗和比較[例（%）]

表2 MTHFR-A1298C基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗和比較[例（%）]

表3 MTHFR基因多態(tài)性與宮頸鱗狀細胞癌發(fā)病風險的關(guān)系分析

Zhu等[4]綜合了13項（共計1 936例患者和2 858例對照）MTHFR基因多態(tài)性和宮頸癌相關(guān)研究，認為MTHFR 677T等位基因可能增加亞洲女性人群患宮頸癌的風險，并對白人女性起到保護作用，此結(jié)論支持本研究結(jié)果，而MTHFR-A1298C基因多態(tài)性與宮頸癌的發(fā)生關(guān)聯(lián)有限；結(jié)果提示MTHFR基因多態(tài)性與宮頸癌的相關(guān)性存在種族特異性分布差異。Botezatu等[5]研究發(fā)現(xiàn)MTHFR 677T等位基因使羅馬尼亞婦女罹患宮頸癌的風險增加3倍，也跟本研究結(jié)論相仿。González-Herrera等[6]研究認為MTHFR-C677T多態(tài)性與墨西哥婦女發(fā)生浸潤性宮頸癌風險缺乏相關(guān)性，MTHFRA1298C多態(tài)性中，雜合子AC基因型和C等位基因與降低患病風險相關(guān)，而純合子AA基因型和A等位基因與浸潤性宮頸癌的患病風險升高相關(guān)，這一結(jié)論跟本研究截然相反。Hajiesmaeil等[7]認為MTHFR 677CC和1298CC與宮頸癌的發(fā)病風險密切相關(guān)，前者跟本研究結(jié)論相反而后者跟本研究結(jié)論一致。張小莉等[8]對蘭州100例宮頸鱗狀細胞癌和100例健康對照研究顯示，MTHFR基因C677T位點多態(tài)性使宮頸鱗癌發(fā)生的風險增加了1．883倍，MTHFR C677是宮頸鱗癌發(fā)生的危險因素，677T對個體罹患宮頸鱗癌的風險無顯著差異，與本研究結(jié)論相反。范巖峰等[9]對廈門市129例病例和214例健康對照研究顯示，宮頸癌的發(fā)病可能與體內(nèi)葉酸水平偏低及生育年齡過早有關(guān)，在MTHFR 1298基因多態(tài)性中，攜帶AC或CC基因型可能是宮頸癌發(fā)病的易感基因，尤其是CC基因型，與本研究的結(jié)論一致。

綜上所述，MTHFR基因多態(tài)性與宮頸鱗狀細胞癌發(fā)病風險的關(guān)系尚無定論，并且存在較大的種族和地域分布差異。由于地理環(huán)境和生活條件的不同，相同的基因突變在不同的人群中所發(fā)揮的作用不同。對于浙江省麗水地區(qū)婦女而言，MTHFR 677T和1298C基因型可能是感染 HPV（16、18、52、58）的宮頸鱗狀細胞癌的高危因素。本文研究的是MTHFR（C677T和A1298C）基因多態(tài)性與 HPV（16、18、52、58）感染的宮頸鱗狀細胞癌發(fā)病風險的關(guān)系，病例組是高危型 HPV（16、18、52、58）感染宮頸鱗狀細胞癌患者，對照組是高危型HPV感染陰性的健康婦女。研究表明，絕大部分婦女感染HPV是一過性，只有持續(xù)高危型HPV感染才可能最終導致宮頸鱗狀細胞癌?；诖耍绻芯縈THFR基因多態(tài)性對高危型HPV感染者患宮頸鱗狀細胞癌的風險，則對照組應該是高危型HPV感染而宮頸鱗狀細胞無改變的健康人群，這也提示筆者可以從這個角度作進一步的研究分析。