劉暢 張治芬

雌性哺乳動(dòng)物卵巢規(guī)律排卵是正常生殖繁衍的前提，而卵巢卵母細(xì)胞發(fā)育始于胚胎期，于出生時(shí)停滯在減數(shù)分裂前期，直至青春期后月經(jīng)中期排卵前黃體生成素（luteotropic hormone，LH）峰解除阻滯[1]后，減數(shù)分裂才能恢復(fù)。近年研究普遍認(rèn)為L(zhǎng)H峰解除阻滯后，卵泡內(nèi)由C型尿鈉肽前體（natriuretic peptide precursor type C，NPPC）編碼的 C 型尿鈉肽（C-type natriuretic peptide，CNP）表達(dá)下降，經(jīng)由一系列信號(hào)傳導(dǎo)通路使卵母細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）水平下降，從而使卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)繼而排卵。LH受體位于壁層顆粒細(xì)胞，卵丘顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞缺乏LH受體[2]，因此，LH觸發(fā)卵母細(xì)胞成熟的機(jī)制是間接的，即LH作用于卵泡的壁層顆粒細(xì)胞后，其信號(hào)必須從壁層顆粒細(xì)胞向卵母細(xì)胞傳導(dǎo)，而其中信號(hào)傳導(dǎo)路徑值得我們深入研究。

巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）作為一種特異性生長(zhǎng)因子，參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的增殖、分化和遷移。一些研究也發(fā)現(xiàn)MCSF參與了卵泡生長(zhǎng)發(fā)育成熟及排卵過(guò)程[3-4]，但其在LH峰后表達(dá)水平的變化曲線尚未知。因此，本研究通過(guò)培養(yǎng)小鼠卵泡并進(jìn)行不同干預(yù)，檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠卵泡內(nèi)M-CSF及其受體（M-CSFR）和NPPC mRNA表達(dá)水平，觀察M-CSF、M-CSFR對(duì)NPPC表達(dá)的影響，探討其是否參與減數(shù)分裂恢復(fù)中的信號(hào)傳導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型的建立 SFP級(jí)雌性青春期前（25d齡）C57BL/6小鼠5只，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2013-0016]，飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)碼SYXK（浙）2014-0008]。小鼠腹腔注射5IU孕馬血清促性腺激素促進(jìn)卵泡發(fā)育，48h后處死小鼠。動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南》的規(guī)定。

1.2 成熟卵泡細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 切取小鼠卵巢，去除周圍脂肪組織，置于37℃ MEMα培養(yǎng)液（含2mmol/L谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和100mg/ml胎牛血清）中。將卵巢對(duì)半剖開(kāi)，半球形朝上放置，在卵巢半球頂部擠壓，卵泡可在半球周邊釋放出來(lái)。仔細(xì)收集排卵前卵泡，每個(gè)卵巢可分離10～15個(gè)卵泡。將搜集的卵泡隨機(jī)分為空白對(duì)照組、人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）組、M-CSF組、GW2580組和M-CSF+GW2580組5組，轉(zhuǎn)移至盛有不同培養(yǎng)液的四孔板中，空白對(duì)照組為MEMα培養(yǎng)液，HCG組為MEMα培養(yǎng)液中滴入HCG 5IU，M-CSF組為MEMα培養(yǎng)液中加入M-CSF 200ng/ml，GW2580組為MEMα培養(yǎng)液中加入M-CSFR阻滯劑GW2580 1μmol/L，M-CSF+GW2580組為MEMα培養(yǎng)液中同時(shí)加入MCSF 200ng/ml及 GW2580 1μmol/L，置于 37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

1.3 卵泡內(nèi)M-CSF、M-CSFR及NPPC mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 培養(yǎng)0.5、1、2、4h時(shí)收集空白對(duì)照組、HCG組、M-CSF組的卵泡，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法檢測(cè)空白對(duì)照組和HCG組小鼠卵泡中M-CSF、MCSFR和NPPC mRNA表達(dá)水平以及M-CSF組小鼠卵泡中NPPC mRNA表達(dá)水平。在培養(yǎng)2h時(shí)收集GW2580組和M-CSF+GW2580組的卵泡，采用熒光定量PCR法檢測(cè)小鼠卵泡中NPPC mRNA表達(dá)水平。熒光定量PCR法具體如下：采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green熒光染料熒光定量PCR法擴(kuò)增，20μl體系（SYBR熒光染料10μl、上下游引物各0.5μl、DEPC 水 8μl、cDNA 1μl）。內(nèi)部參照管家基因選擇 Rpl19。引物設(shè)計(jì)采用Rrimer Primer 5.0軟件包，具體設(shè)計(jì)信息見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性30s，隨后95℃ 5s，60℃20s，40 個(gè)循環(huán)，采用相對(duì)定量 2-ΔΔCt計(jì)算基因表達(dá)水平。所有檢測(cè)至少進(jìn)行3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 空白對(duì)照組和HCG組小鼠卵泡中M-CSF和MCSFR mRNA表達(dá)水平比較 空白對(duì)照組小鼠卵泡中M-CSF和M-CSFR mRNA表達(dá)水平均呈上升趨勢(shì)，培養(yǎng)2、4h時(shí)M-CSF mRNA表達(dá)水平均較培養(yǎng)0.5、1h時(shí)升高，培養(yǎng)1、2、4h時(shí)M-CSFR mRNA表達(dá)水平均較0.5h升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中培養(yǎng)1h與2h的M-CSFR mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而HCG組小鼠卵泡中M-CSF和MCSFR mRNA均呈低水平表達(dá)，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）?？瞻讓?duì)照組和HCG組小鼠卵泡培養(yǎng)2、4h時(shí)M-CSF mRNA表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），培養(yǎng) 1、2、4h 時(shí) M-CSFR mRNA表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖 1-2。

表1 引物序列

圖1 空白對(duì)照組和HCG組小鼠卵泡中M-CSF mRNA表達(dá)水平比較

圖2 空白對(duì)照組和HCG組小鼠卵泡中M-CSFR mRNA表達(dá)水平比較

2.2 空白對(duì)照組、HCG組和M-CSF組小鼠卵泡中NPPC mRNA表達(dá)水平比較 空白對(duì)照組小鼠卵泡不同時(shí)間點(diǎn)NPPC mRNA表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；而HCG組和M-CSF組小鼠卵泡培養(yǎng)2h時(shí)NPPC mRNA表達(dá)水平均有不同程度的升高，與組內(nèi)其他時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），并在培養(yǎng)2h時(shí)達(dá)到峰值，隨即下降；培養(yǎng)2h時(shí)HCG組小鼠卵泡中NPPC mRNA表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組和M-CSF組，M-CSF組小鼠卵泡中NPPC mRNA表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見(jiàn)圖 3。

2.3 各組小鼠卵泡培養(yǎng)2h時(shí)NPPC mRNA表達(dá)水平比較 GW2580組、M-CSF+GW2580組小鼠卵泡中NPPC mRNA表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而與空白對(duì)照組比較，HCG組NPPC mRNA明顯升高，M-CSF組NPPC mRNA輕度升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖3 空白對(duì)照組、HCG組和M-CSF組小鼠卵泡中NPPC mRNA表達(dá)水平比較

圖4 各組小鼠卵泡培養(yǎng)2h時(shí)NPPC mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

M-CSF是由單核吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種特異性生長(zhǎng)因子，屬于造血因子，分子質(zhì)量為40～90ku，其基因位于第5號(hào)染色體上，與其相應(yīng)受體結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)作用。M-CSFR是c-fms原癌基因編碼的跨膜糖蛋白，屬于酪氨酸激酶受體家族。1992年Arceci等[3]研究發(fā)現(xiàn)妊娠期輸卵管及子宮均表達(dá)M-CSF，并在卵母細(xì)胞、著床前胚胎和胎盤(pán)中亦可檢測(cè)到M-CSFR的表達(dá)。由此發(fā)現(xiàn)MCSF及其受體在生殖系統(tǒng)中的作用。隨后有研究發(fā)現(xiàn)M-CSF基因缺失小鼠發(fā)情周期延長(zhǎng)，成熟卵泡減少，排卵率降低，而給予補(bǔ)充M-CSF后可逆轉(zhuǎn)上述改變[4]，該研究證實(shí)了M-CSF在卵泡發(fā)育成熟及排卵中的重要作用。在卵泡發(fā)育早中期，卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）刺激顆粒細(xì)胞分泌雌激素（estradiol，E2）和M-CSF，而E2水平增加后反過(guò)來(lái)刺激卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌M-CSF，故推測(cè)FSH對(duì)卵泡發(fā)育和成熟的調(diào)節(jié)作用部分通過(guò)M-CSF及其受體通道完成[5]。卵泡內(nèi)不斷升高的M-CSF水平誘導(dǎo)較多巨噬細(xì)胞進(jìn)入卵泡內(nèi)，而巨噬細(xì)胞分泌因子在調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)、激素合成、排卵、顆粒細(xì)胞增殖與分化方面都有重要作用。然而LH/HCG峰后減數(shù)分裂重新啟動(dòng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路中M-CSF的具體作用機(jī)制尚未知。本研究取促排卵小鼠模型卵巢內(nèi)卵泡進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)改變卵泡培養(yǎng)基成分，探索M-CSF及其受體M-CSFR對(duì)NPPC mRNA的影響，結(jié)果顯示空白對(duì)照組M-CSF、M-CSFR mRNA表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，而HCG組M-CSF、M-CSFR mRNA均呈低水平表達(dá)。Zhang等[6]研究顯示卵泡發(fā)育過(guò)程中，血清M-CSF及其受體表達(dá)呈上升趨勢(shì)并在排卵日達(dá)到峰值，而卵泡內(nèi)M-CSF水平遠(yuǎn)高于血清。因此，在未干預(yù)的情況下，卵泡內(nèi)各種類固醇激素、細(xì)胞因子、蛋白激酶等互相作用保持卵泡處于逐漸發(fā)育成熟的狀態(tài)，MCSF及其受體表達(dá)繼續(xù)呈上升趨勢(shì)。而HCG組，在HCG的刺激下，M-CSF、M-CSFR均呈低表達(dá)狀態(tài)，提示LH/HCG峰后，卵泡內(nèi)M-CSF及其受體表達(dá)明顯下降，繼而影響到血清濃度。既往有研究體外培養(yǎng)黃素化顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其E2表達(dá)與顆粒細(xì)胞分泌的M-CSF水平呈正相關(guān)[6]，故推測(cè)LH峰后M-CSF及其受體表達(dá)下降與E2水平下降有關(guān)。

國(guó)內(nèi)外研究均證實(shí)小鼠排卵前LH峰可抑制卵巢顆粒細(xì)胞分泌CNP，減少CNP與其受體結(jié)合，降低cGMP的合成，從而促進(jìn)排卵前卵母細(xì)胞的成熟和減數(shù)分裂的恢復(fù)[7]。有研究指出LH峰后2～3h可見(jiàn)卵泡內(nèi)CNP明顯下降[8]，這與本研究結(jié)果一致。本研究空白對(duì)照組小鼠卵泡中NPPC mRNA表達(dá)水平未見(jiàn)明顯增減，而HCG組可見(jiàn)其先逐步上升后快速下降，并在2h達(dá)到峰值。此外M-CSF組NPPC變化曲線與HCG組相類似，而GW2580組和M-CSF+GW2580組NPPC mRNA表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較未見(jiàn)明顯差異，均未見(jiàn)NPPC mRNA表達(dá)水平明顯增減，由此推測(cè)LH/HCG峰通過(guò)抑制卵泡內(nèi)M-CSF及其受體表達(dá)，導(dǎo)致卵泡內(nèi)NPPC水平上升至峰值后下降，繼而影響cGMP及環(huán)磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)及排卵的發(fā)生。而M-CSF組2h時(shí)NPPC峰值明顯低于HCG組，考慮存在以下3種可能性：（1）M-CSF作為L(zhǎng)H/HCG的下游因子，其作用效能低于HCG；（2）本研究培養(yǎng)基中加入了 M-CSF 200ng/ml，提高M(jìn)-CSF濃度可能導(dǎo)致NPPC峰值升高；（3）卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂所需的NPPC閾值尚未知，對(duì)此，我們可以進(jìn)一步研究不同濃度M-CSF對(duì)卵泡內(nèi)NPPC表達(dá)的影響，探索生發(fā)泡破裂所需的卵泡內(nèi)NPPC閾值濃度。

綜上所述，M-CSF作為一種特異性生長(zhǎng)因子，在卵泡發(fā)育和成熟及減數(shù)分裂恢復(fù)中起到重要作用。排卵前LH峰可能通過(guò)抑制卵泡內(nèi)M-CSF及其受體表達(dá)，而使卵泡內(nèi)NPPC水平上升至峰值后快速下降，繼而影響cGMP及cAMP水平，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)及排卵的發(fā)生。