吳鴻儒 吳舊生 王志遠 劉月環(huán)

CDC42作用蛋白 4（CDC42 interacting protein 4，CIP4）又稱作甲狀腺素受體作用因子10，能與甲狀腺素受體結(jié)合，其表達受全反式維甲酸調(diào)節(jié)，作為活化的CDC42的一種下游靶蛋白，CIP4在細胞骨架（由肌動蛋白、微管及中間絲共同構(gòu)成）的形成和重排，調(diào)節(jié)細胞的變形（偽足）、黏附、吞噬及胞質(zhì)移動等過程中起著重要的作用[1]。CIP4能下調(diào)表皮生長因子受體[2]，沉默CIP4基因后，導致間充質(zhì)干細胞出現(xiàn)多種分化傾向并能減少腫瘤的轉(zhuǎn)移[3]。CIP4基因敲除小鼠表現(xiàn)出餐后低血糖，對胰島素不敏感，對葡萄糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白吸收下降等多方面效應[4]。高脂飲食造成胰島素抵抗的大鼠磷酸酶高表達從而抑制了脂肪組織中CIP4的表達[5]。腎纖維化研究表明，在轉(zhuǎn)化生長因子 β1（TGF-β1）參與下（Wnt信號通路），CIP4可能是通過酪氨酸殘基的磷酸化而促使β連環(huán)蛋白（β-catenin）與 E-鈣黏附素（E-cadherin）解聚的方式來促進上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT），從而發(fā)揮其促腎臟纖維化的作用[6]。但該基因在TGF-β1參與下的肝纖維化中是否與β-catenin有相互作用的關系或CIP4的表達是否受β-catenin調(diào)控仍不明確。鑒于非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）在肝領域研究的迅速發(fā)展，筆者課題組自2005年以來歷經(jīng)10年時間建立的長爪沙鼠NAFLD模型目前以成模時間短、病理譜全面、與人類癥狀相似性高且適于動態(tài)觀察病程進展的特色而成為一個不可多得的模型[7-8]。本研究試圖用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，CoIP）的方法來驗證長爪沙鼠NAFLD模型中CIP4與β-catenin兩者的相互關系，為研究肝纖維化的機制提供證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 模型的建立 3月齡雄性長爪沙鼠30只購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心并飼養(yǎng)于該中心的動物房[許可證號：SCXK（浙）2014-0001，SYXK（浙）2014-0008]，體質(zhì)量50～70g，采用隨機數(shù)字表法分為正常組（Z組）6只和模型組（M組）24只。M組按飼喂高脂飼料的時間不同分為 2周組（2M 組）、4周組（4M 組）、8周組（8M組）、12周組（12M組），每組6只。高脂飼料由本課題組自行配制，成分及配比如下：80.5%的基礎料（符合GB14924.3-2010）、7%的豬油、2%的膽固醇、0.5%的膽鹽、10%的蛋黃粉。本研究經(jīng)浙江省醫(yī)學科學院實驗動物倫理委員會批準同意，倫理審批號：2018-094。

1.2 肝臟樣品的采集 M組長爪沙鼠分別于造模后2、4、8、12周末的最后一天晚上禁食禁飲（Z組處理同M組），CO2麻醉，取肝臟的大葉部分，分成4份，1份用于制作病理切片；其余3份貯存于-80℃，用于肝臟CIP4基因的熒光定量PCR（qPCR）、蛋白免疫印跡（Western blot）及與β-catenin相互作用的CoIP實驗。

1.3 HE染色、Masson染色與肝纖維化的分期 取各組長爪沙鼠肝臟大葉相同部位一片，制作切片并做HE染色與Masson染色觀察。根據(jù)中華醫(yī)學會肝纖維化診斷及治療共識（2019年）中肝纖維化的分期標準，將模型各階段分為S0～S3期。S0期：肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，小葉間僅含有少量結(jié)締組織和膠原纖維，匯管區(qū)和中央靜脈大小正常，偶見輕度脂肪變性。S1期：匯管區(qū)、中央靜脈均擴大，小葉結(jié)構(gòu)清晰，細胞完整，偶見小葉間結(jié)締組織和膠原纖維有所增加，肝組織呈輕度脂肪性。S2期：匯管區(qū)、中央靜脈均明顯擴大，有較多肝細胞發(fā)生脂肪變性，小葉間結(jié)締組織和膠原纖維明顯增加，在匯管區(qū)之間，中央靜脈與匯管區(qū)之間均可見有膠原纖維沉積，逐漸形成完整的一層纖維分隔，所謂橋接。S3期：膠原纖維在小葉間、部分匯管區(qū)與門管區(qū)之間形成完整的小葉間隔，肝和正常結(jié)構(gòu)受到明顯破壞，可見纖維橋接，組織脂肪變性。

1.4 各組沙鼠CIP4 mRNA相對表達量檢測 采用qPCR法。二步法提取總RNA，然后DNase I消化去基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，反轉(zhuǎn)錄反應采用杭州寶賽公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RT02020）。提取總RNA的組分包括 DNase I 2μl，Buffer 2μl，RNA 18μl，37℃反應 10min，加入 2μl終止 Buffer，70℃ 10min 滅活 DNase I；反轉(zhuǎn)錄組分包括：M-MLV 1μl，5×RT Buffer 4μl，RNase A 抑制劑1μl，OligdT（18）1μl，dNTP 1μl，RNA 1μg，Rnase-free H2O補至 20μl，42℃ 45min，70℃ 10min 滅活 M-MLV。mRNA引物設計與合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成，以GAPDH為內(nèi)參對照，引物序列見表1。qPCR反應體系如下：20μl體系里含有 2×熒光定量 PCR Mix 10μl，上游引物（10μM）1μl，下游引物（10μM）1μl，模板 DNA 1μl，雙蒸水 7μl。反應程序如下：94℃模板預變性 1min，94℃模板變性10s，58℃引物退火10s，72℃ PCR延伸10s，共 40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算基因表達水平。

表1 引物序列

1.5 各組沙鼠CIP4蛋白相對表達量檢測 采用Western blot法。冷PBS洗凈肝臟組織塊并剪碎，適當體積的組織預冷裂解液（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，終濃度 1mM）勻漿，轉(zhuǎn)管、混勻、吹打、裂解，12 000rpm 4℃離心10min，上清液分裝，BCA法測蛋白濃度，并標準化成35μg/樣。制備分離膠濃度為10%，濃縮膠為5%，標準上樣，濃縮膠用80V電壓，分離膠改用120V，電泳畢后濕轉(zhuǎn)法200mA轉(zhuǎn)膜1h。然后進入免疫印跡（IB），室溫下用5%的脫脂牛奶（0.5%TBST配置）封閉膜2h（邊搖邊封閉），用1:1 000的比例稀釋一抗β-catenin和CIP4，4℃過夜。第2天用1×TBST室溫下?lián)u洗3次，間隔15min，用1:5 000的比例稀釋二抗（goat anti-rabbit HRP二抗），室溫下孵育2h，期間用1×TBST在室溫下?lián)u洗3次，間隔15min。之后用化學發(fā)光法顯影，Image J軟件圖像分析。

1.6 CIP4與β-catenin的CoIP驗證 每只沙鼠稱取100mg組織樣品，用PBS洗2次，盡量洗去組織的血液成分，勻漿之后，13 000rpm 4℃離心10min。轉(zhuǎn)移上清液到新的EP管內(nèi)，取10%體積的上清液加入等體積5×SDS作為Input，剩余放置冰上待用；將上述剩余裂解液加入一定體積的NP40 lysis Buffer（加1mM PMSF和1mM DTT）補齊 500μl，根據(jù)抗體說明書加入 1μg 的抗體β-catenin，4℃搖床上搖過夜；第2天，每個EP管加入 20μl protein A/G beads，4℃搖床上繼續(xù)搖 2h；取出免疫沉淀（IP）管，4℃ 1 000rpm離心1min，用磁性分離器分離 beads，用 200μl的 Wash Buffer洗 3遍，beads加入50μl的2×SDS煮樣。其余步驟同1.5。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟形態(tài)學檢查 HE染色觀察到Z組沙鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，細胞核大而清晰，胞質(zhì)豐富。M組沙鼠肝組織呈脂肪病變，絕大多數(shù)肝細胞胞質(zhì)內(nèi)有大小不等的脂肪空泡，細胞核大小不均，被脂肪空泡擠向一側(cè)，肝細胞出現(xiàn)一定程度的壞死。Masson染色觀察到Z組沙鼠肝竇組織結(jié)構(gòu)整齊，細胞核藍染而清晰，胞質(zhì)豐富，視野下細胞無變性、腫脹，無膠原纖維、可見明顯的小葉間結(jié)締組織。M組沙鼠肝組織大部分肝細胞網(wǎng)泡狀，氣球狀腫脹，細胞核固縮崩解，脫落，細胞間脂肪空泡，被脂肪空泡擠向一側(cè)，并在匯管區(qū)及其周圍、細胞間可見纖維組織增生，出現(xiàn)纖維化（圖1，見插頁）。

2.2 各組沙鼠CIP4 mRNA相對表達量比較 各組沙鼠CIP4 mRNA相對表達量排序為4M組＞Z組＞8M組＞12M組＞2M組，谷值出現(xiàn)在2M組，即單純脂肪肝階段。峰值出現(xiàn)在4M組，即CIP4 mRNA相對表達量峰值出現(xiàn)在4M組，這個階段是處在S1～S2期，即脂肪性肝炎早期階段，見圖2。

圖2 各組沙鼠CIP4 mRNA相對表達量比較（a：CIP4基因的熔解曲線；b：CIP4基因的擴增曲線；c：內(nèi)參GAPDH的熔解曲線；d：內(nèi)參GAPDH的擴增曲線；e：各組沙鼠CIP4 mRNA相對表達量，與Z組比較，*P＜0.05）

2.3 各組沙鼠CIP4蛋白相對表達量比較 Z組CIP4蛋白相對表達量最高，M組CIP4蛋白相對表達量均有所下降，各組CIP4蛋白相對表達量排序為Z組＞8M組＞12M組＞4M組＞2M組。谷值出現(xiàn)在2M組，即單純脂肪肝階段；峰值出現(xiàn)在8M組，即重癥脂肪性肝炎及早期的肝纖維化階段，見圖3。8M組出現(xiàn)CIP4蛋白相對表達量的峰值可能與其處在S2～S3期的轉(zhuǎn)折點有關，CIP4蛋白相對表達量在從正常到單純的脂肪肝階段是上調(diào)（S0～S1，Z組/2M～4M），接著隨著脂肪不停地堆積，自身保護性下調(diào)，肝穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)第一次平衡，但肝細胞一直進行修復，一直到炎癥出現(xiàn)及纖維化形成時（S1～S2，4M～12M），肝細胞破壞嚴重，肝實質(zhì)細胞凋亡，而肝星狀被激活，肝臟修復能力漸衰，肝穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)第二次平衡，但此時CIP4蛋白相對表達量有個峰值（8M組），但此峰值不及Z組的表達量大。在肝臟修復能力逐漸衰竭過程中，CIP4蛋白相對表達量下降，肝臟變硬的過程中，肝臟細胞胞吞、吐能力也隨之改變。

圖3 各組沙鼠CIP4蛋白相對表達量比較（a：各組沙鼠CIP4蛋白相對表達的電泳圖，內(nèi)參為β-actin；b：各組沙鼠CIP4蛋白相對表達量，與Z組比較，*P＜0.05）

2.4 CIP4與β-catenin的相互作用 從圖4a-d（原始圖）可以看出，CIP4蛋白大小為 70～100kD，β-catenin蛋白大小為100～130kD。Input中可以看出，Z組和M組中CIP4和β-catenin蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。利用β-catenin抗體IP之后，與Z組相比，M組中沉淀的CIP4蛋白相對表達量明顯下降，IB之后（圖4e）表明造模之后β-catenin與CIP4的相互作用減少（M1和M2分別對應S0～S1與S2～S3期的模型，這兩組病理進程對應于脂肪肝與炎癥及肝纖維化階段，即隨著病理進程發(fā)展，β-catenin與CIP4的相互作用越來越少）。

圖4 CIP4與 β-catenin的 CoIP 結(jié)果（a：CoIP中 CIP4的陽性對照（Input）；b：IP 后的 CIP4；c：CoIP 中 β-catenin的陽性對照（Input）；d：IP后的β-catenin；e：IB后的結(jié)果，即CIP4與β-catenin的相互作用，其中Input為陽性對照，Z組、模型組各取2個樣，M1為S0～S1期，M2為 S2～S3期）

3 討論

本實驗病理結(jié)果證實造模2周為單純脂肪肝（S0期），4周后開始出現(xiàn)纖維化（S1期），8周出現(xiàn)橋接，12周部分肝葉形成假小葉，HE染色和Masson染色在2、4、8和12周造模過程中纖維化進展的程度高度一致（與S0～S3期吻合）。這時CIP4 mRNA相對表達量在2周時先是下調(diào)，接著在4周時上調(diào)到峰值，接著又開始下降，而CIP4蛋白相對表達量則較CIP4 mRNA相對表達量遲一點，到8周（S2期）才達峰值，隨后下降，谷值出現(xiàn)在2周（S0期）。從總體表達量上看，CIP4 mRNA和蛋白相對表達量均與炎癥和纖維化形成有關，且在這個過程中呈現(xiàn)下降趨勢。CIP4是一個調(diào)節(jié)膜變形卷曲的細胞肌動蛋白，兼有生長因子受體內(nèi)吞及運輸載體作用，其低表達導致膜變硬，弱化了T細胞的遷移及黏附的功能，活化了p38/絲裂原活化蛋白激酶（p38/MAPK）通路[9]。本實驗CIP4隨著NAFLD的持續(xù)進展，呈現(xiàn)出一個峰值后，即轉(zhuǎn)向持續(xù)低表達，這個過程也是脂肪的不斷堆積，肝臟柔軟度越來越差，趨向硬化的過程。

最新的肝纖維化相關研究進展認為促纖維化因子（TGF-β1、NF-κB、腎素、血管緊張素等）上調(diào)了細胞外基質(zhì)基因表達，同時抑纖維化因子IFN-γ致促膠原降解基因表達下降，致膠原過量堆積而致纖維化[10]，以上理論中關于CIP4的作用尚是空白。抑制不同細胞中CIP4基因后導致細胞多種分化結(jié)果，其中一種是纖維化，這說明調(diào)節(jié)該基因可以用來研究肝纖維化的發(fā)生機制。CIP4是PCH家族的一個成員，具有與磷脂酰絲氨酸結(jié)合的FER類似區(qū)和一個SH3區(qū)域。該基因的轉(zhuǎn)錄激活/抑制主要取決于其3個結(jié)構(gòu)域，一個是TRRXR/PPAR-RXR二聚體的結(jié)合區(qū)（FCH區(qū)），一個是CDC42結(jié)合的HR1區(qū)，另一個是SH3區(qū)，即富含脯氨酸，可與下游特定泛素化的靶蛋白結(jié)合[11]。腫瘤細胞實驗和腎纖維化研究表明CIP4可通過SH3區(qū)的脯氨酸與β-catenin結(jié)合，而β-catenin（第654位點酪氨酸殘基）磷酸化易被泛素化降解，鑒于β-catenin是一個經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導蛋白，因此可能通過與CIP4結(jié)合而對CIP4表達起調(diào)節(jié)作用[6，12]。本研究中CoIP法結(jié)果表明，M組中CIP4與β-catenin之間結(jié)合程度小于Z組，而且可能隨著肝纖維化的發(fā)展結(jié)合程度越來越小。結(jié)合該基因在其他領域[13-14]的研究進展推斷隨著NAFLD病程的進展，CIP4內(nèi)吞作用的破壞導致β-catenin出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位，細胞極性發(fā)生變化，致使肝細胞黏附連接復合物（上皮細胞轉(zhuǎn)分化過程中的一種細胞形態(tài)）的完整性不能維持，從而促進肝細胞轉(zhuǎn)分化過程，其結(jié)果是肝實質(zhì)逐漸為肝星狀細胞取代，肝臟逐漸纖維化，這時肝臟外觀上看是從柔軟趨向硬化的過程。

綜上所述，長爪沙鼠NAFLD模型中CIP4隨著造模時間的延長，呈現(xiàn)出低表達的趨勢，可能與炎癥及纖維化有關且受β-catenin的調(diào)控。