肖秀麗，唐明會(huì)

(上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 201999)

痔瘡(hemorrhoids)是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，在人群中的患病率為87.3%[1]。對(duì)于Ⅰ、Ⅱ期內(nèi)痔可以通過(guò)非手術(shù)療法治療，筆者前期采用挑治療法治療Ⅰ、Ⅱ期內(nèi)痔，收到較好的臨床療效，有效率達(dá)95.0%[2]，尤其對(duì)于便血、水腫和肛門(mén)墜脹感等癥狀的改善更具有優(yōu)勢(shì)。為進(jìn)一步探討其作用機(jī)理，本文對(duì)不同組別的痔瘡患者及正常患者外周血Toll樣受體4(TLR4)和核因子-κB(NF-κB) p65 mRNA表達(dá)及白細(xì)胞介素-12(IL-12)和干擾素-α(IFN-α)含量情況進(jìn)行了觀(guān)察，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料

本研究共收集有完整記錄的觀(guān)察病例30例，來(lái)自上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肛腸科2017年6月至2018年10月住院和門(mén)診患者，以及正常志愿者15例。按照隨機(jī)數(shù)字表法將患者隨機(jī)分為挑治組、太寧栓組。本研究經(jīng)上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。挑治組和太寧栓組患者性別、年齡、病程、痔瘡分類(lèi)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]

參照2006年7月中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)結(jié)直腸肛門(mén)外科學(xué)組、中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)肛腸病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)、中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)結(jié)直腸肛門(mén)病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)修訂的《痔臨床診治指南(草案)》相關(guān)診斷。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者;②年齡 18～65，男女不限;③近半月內(nèi)未治療者;④簽署知情同意書(shū)者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①合并有其他肛門(mén)疾病者;②肛管、直腸有占位性病變者;③惡性腫瘤和精神病患者;④合并有嚴(yán)重心腦血管、肝、腎疾病及肝腎功能異常者;⑤合并血液系統(tǒng)疾病、自身免疫病、慢性嚴(yán)重感染、糖尿病及精神病患者;⑥合并有背部及全身性皮膚疾病患者;⑦妊娠期婦女。

1.5 剔除和脫落標(biāo)準(zhǔn)

①未按規(guī)定治療，無(wú)法判斷療效者;②治療過(guò)程中發(fā)生意外事件而不能堅(jiān)持治療者;③治療過(guò)程中患者不配合治療者。

2 治療方法

2.1 挑痔組

采用痔點(diǎn)挑治法治療，每周1次，2次為1個(gè)療程。

2.2 太寧栓組

用太寧栓塞肛治療，每日1次，2周為1個(gè)療程。

2.3 正常組

不給予干預(yù)。

治療期間均停用其他相關(guān)治療藥物，忌食辛辣及刺激性食物。

3 治療效果

3.1 觀(guān)察指標(biāo)

抽取3組靜脈血10 mL，4000 rpm離心5 min，取血清分裝待檢。5 d內(nèi)檢測(cè)的標(biāo)本于4℃冰箱保存，短期內(nèi)無(wú)法檢測(cè)標(biāo)本分裝后于-80℃低溫冰箱保存，避免反復(fù)凍融。

3.1.1 血清TLR4和NF-κB p65含量表達(dá)

采用熒光定量PCR法。①總RNA抽提，槍頭和離心管均經(jīng)過(guò)濕熱滅菌且無(wú)RNA酶，取200 μL的全血加入800 μL的RNA提取液渦旋混合，加入250 μL三氯甲烷，顛倒離心管 15 s，充分混勻，靜置 3 min。4℃下12000 rpm離心10 min。將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻。-20℃放置15 min。4℃下12000 rpm離心10 min，管底的白色沉淀即為RNA。吸除液體，加入75%乙醇1.5 mL洗滌沉淀。4℃下12000 rpm離心10 min。將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺(tái)上吹3 min。加入15 μL無(wú)RNA酶的水溶解 RNA。55℃孵育 5 min。使用 Nanodrop 2000檢測(cè)RNA濃度及純度，儀器空白調(diào)零后取2.5 μL待測(cè)RNA溶液于檢測(cè)基座上，放下樣品臂，使用電腦上的軟件開(kāi)始吸光值檢測(cè)。將濃度過(guò)高的RNA進(jìn)行適當(dāng)比例的稀釋?zhuān)蛊浣K濃度為 200 ng/μL。②反轉(zhuǎn)錄，取一根PCR管，加入含 2 μg RNA的溶液。加入 1 μL oligo(dT)18。用無(wú)核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至 12 μL。于PCR儀上65℃保溫5 min，迅速置冰上冷卻。依次加入 4 μL 5×buffer，2 μL 10 mM dNTPs，1 μL RNA inhibitor和 1 μL反轉(zhuǎn)錄酶，用槍抽吸混勻。于 PCR儀上42℃保溫60 min，結(jié)束后80℃保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。③定量PCR。取0.2 mL PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制 3管。2×qPCR Mix 12.5 μL 7.5 μM基因引物2.0 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μL、ddH2O 8.0 μL。PCR擴(kuò)增預(yù)變性95℃，10 min循環(huán)(40次)95℃，15 s→60℃，60 s 溶解曲線(xiàn) 75℃→95℃，每20 s升溫1℃。結(jié)果處理采用Δ Δ CT法，A=CT(目的基因，待測(cè)樣本)－CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測(cè)樣本);B=CT(目的基因，對(duì)照樣本)－CT(內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本);K=A－B;表達(dá)倍數(shù)=2-K。

3.1.2 血清IL-12和IFN-α含量表達(dá)

采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗人IL-12單抗和抗人單抗 IFN-α包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的人 IL-12、IFN-α分別與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人IL-12和抗人IFN-α抗體，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物 OPD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492 nm處測(cè)OD值，人IL-12和IFN-α濃度與 OD值呈正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出標(biāo)本中人IL-12和TNF-α濃度。

3.2 療效標(biāo)準(zhǔn)

參照《上海市中醫(yī)病證診療常規(guī)》[4]，根據(jù)治療前后的癥狀積分，詳見(jiàn)表 2，按照療效指數(shù)將療效分為痊愈、顯效、有效、無(wú)效4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。療效指數(shù)(尼莫地平法)=[(治療前積分－治療后積分)/治療前積分]×100%。

痊愈:癥狀消失，痔核消失或全部萎縮。療效指數(shù)≥95%。

顯效:癥狀明顯改善，痔核縮小或萎縮不全，療效指數(shù)70%～94%。

有效:癥狀改善，痔核縮小，療效指數(shù)30%～69%。

無(wú)效:癥狀和體征均無(wú)明顯變化或變化不明顯，療效指數(shù)＜30%。

總有效率=[(痊愈例數(shù)＋顯效例數(shù)＋有效例數(shù))÷總例數(shù)]×l00%。

表2 痔瘡癥狀積分

3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0 for Windows軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料如服從正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用單因素方差分析;方差不齊，先校正方差，然后進(jìn)行方差分析;計(jì)量資料不符合正態(tài)性檢驗(yàn)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率表示，采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 治療結(jié)果

3.4.1 兩組臨床療效比較

挑治組治療后總有效率為 86.7%，顯著高于對(duì)照組的60.0%(P＜0.05)。詳見(jiàn)表3。

3.4.2 兩組臨床癥狀積分比較

挑治組患者出血、肛門(mén)墜脹、水腫癥狀積分明顯優(yōu)于太寧栓組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩組疼痛、脫出癥狀積分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見(jiàn)表4。

表3 兩組臨床療效比較 (例)

表4 兩組臨床癥狀積分比較 (±s，分)

表4 兩組臨床癥狀積分比較 (±s，分)

注:與太寧栓組比較1)P＜0.05

組別 例數(shù) 疼痛 出血 肛門(mén)墜脹 脫出 水腫挑治組 15 2.03±0.90 1.10±0.221) 1.57±1.101) 3.12±1.14 1.22±0.321)太寧栓組 15 1.90±0.84 3.70±0.55 3.26±0.73 2.97±0.89 3.78±0.73

3.4.3 3組血清TLR4和NF-κB p65表達(dá)比較

挑治組血清TLR4 mRNA擴(kuò)增倍數(shù)明顯高于太寧栓組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);挑治組血清NF-κB p65 mRNA擴(kuò)增倍數(shù)明顯高于太寧栓組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見(jiàn)表5。

表5 3組血清TLR4和NF-κB p65表達(dá)比較 (±s)

表5 3組血清TLR4和NF-κB p65表達(dá)比較 (±s)

注:與太寧栓組比較1)P＜0.05

組別 例數(shù) TLR4 NF-κB p65挑治組 15 4.04±2.831) 2.19±0.861)太寧栓組 15 1.09±1.48 0.81±0.85正常組 15 2.59±3.51 2.34±2.631)

3.4.4 3組血清IL-12和IFN-α含量比較

挑治組血清IL-12和IFN-α含量均明顯高于太寧栓組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見(jiàn)表6。

表6 3組血清IL-12和IFN-α含量比較 (±s，pg/mL)

表6 3組血清IL-12和IFN-α含量比較 (±s，pg/mL)

注:與太寧栓組比較1)P＜0.05;與正常組比較2)P＜0.05

組別 例數(shù) IL-12 IFN-α挑治組 15 81.37±48.101) 31.93±7.111)太寧栓組 15 25.28±6.962) 16.73±4.622)正常組 15 69.98±9.19 25.54±4.60

4 討論

挑治法歷史悠久，起源于九針之后，民間流傳甚廣[5-6]?！夺樉募滓医?jīng)》就記載有“痔痛攢竹主之;痔，會(huì)陰主之”。是運(yùn)用三棱針在疾病反應(yīng)點(diǎn)或穴位挑斷皮下纖維樣組織，以達(dá)通經(jīng)活絡(luò)、調(diào)和氣血、瀉熱消腫之效而治療疾病的一種方法[7-8]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，挑治背部經(jīng)脈能協(xié)調(diào)陰陽(yáng)、行氣活血，而膀胱經(jīng)別經(jīng)過(guò)尾骶部，督脈又直通會(huì)陰，故挑治背部經(jīng)脈上的痔點(diǎn)或穴位能達(dá)到治療痔瘡的目的[9]。

熊?chē)?guó)華等[10-11]運(yùn)用痔點(diǎn)挑治法配合拔罐治療內(nèi)痔，治療組總有效率為82.69%。賈立剛[12]運(yùn)用化痔洗劑結(jié)合穴位挑刺治療炎性及血栓性外痔 843例，治療組總有效率為91.93%。周岳松[13]運(yùn)用痔點(diǎn)挑刺配合痔瘡栓直腸給藥治療痔瘡，治療組總有效率為95%。本研究觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，挑治法治療Ⅰ、Ⅱ期內(nèi)痔療效明顯優(yōu)于太寧栓治療組，與文獻(xiàn)報(bào)道研究結(jié)果一致。但目前的文獻(xiàn)研究中大多數(shù)只說(shuō)明了治療后癥狀改善明顯，但忽略了局部體征變化這一重要療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。所以本試驗(yàn)針對(duì)患者的癥狀體征進(jìn)行了進(jìn)一步的觀(guān)察，觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，挑治組患者出血、肛門(mén)墜脹、水腫癥狀改善明顯，患者治療后癥狀積分改善明顯優(yōu)于太寧栓組。上述結(jié)果表明挑治法在改善Ⅰ、Ⅱ期內(nèi)痔患者便血、痔瘡水腫和肛門(mén)墜脹感方面更具有優(yōu)勢(shì)。

痔瘡具有勞累時(shí)發(fā)作加重的典型特點(diǎn)，是中醫(yī)學(xué)“邪之所湊，其氣必虛”理論的體現(xiàn)。針刺刺絡(luò)療法在調(diào)整機(jī)體免疫功能方面具有優(yōu)勢(shì)[14]，可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞如T細(xì)胞亞群、吞噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞[15]，及T、B淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞等[16]，免疫分子如免疫球蛋白、細(xì)胞因子等，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，既能使紊亂的免疫功能趨向正常，也能增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力，是“正氣存內(nèi)，邪不可干”理論的體現(xiàn)[17]。

Toll樣受體(TLR)是宿主細(xì)胞識(shí)別各種微生物致病成分的受體，能特異性地識(shí)別病原相關(guān)分子結(jié)構(gòu)或體內(nèi)的“危險(xiǎn)信號(hào)”，誘導(dǎo)獲得性免疫。NF-κB位于TLR下游信號(hào)通路的樞紐位置，廣泛分布于免疫細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激刺激后，NF-κB活化進(jìn)入細(xì)胞核后，調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子、細(xì)胞增殖(抗凋亡)等基因的轉(zhuǎn)錄，參與炎癥調(diào)節(jié)、淋巴細(xì)胞成熟、獲得性免疫的發(fā)生[18]。崔瑞等[19]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)針刺產(chǎn)生的多種內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)作為配體與TLR4結(jié)合后，即可通過(guò)其介導(dǎo)的通路激活NF-κB，NF-κB 活化并轉(zhuǎn)位到胞核，啟動(dòng) IFN-α、IL-12等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，使得 IFN-α、IL-12的分泌增多，單核細(xì)胞的分裂增殖增強(qiáng)，從而誘導(dǎo)機(jī)體的獲得性免疫機(jī)能。楊玉榮等[20]推測(cè)Gal-13是與TLR4結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用;同時(shí)， Gal-13可促進(jìn)單核細(xì)胞 NF-κB的活化，IL-12及 IFN-α炎癥介質(zhì)的分泌，進(jìn)而表現(xiàn)為促進(jìn)單核細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞免疫功能。

本研究運(yùn)用PCR法對(duì)挑治組、太寧栓組和正常組3組外周血中TLR4和NF-κB p65mRNA表達(dá)情況指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)挑治組TLR4 mRNA擴(kuò)增倍數(shù)明顯高于太寧栓組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);挑治組NF- κB p65 mRNA擴(kuò)增倍數(shù)明顯高于太寧栓組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);太寧栓組NF-κB p65擴(kuò)增倍數(shù)明顯低于挑治組和正常組。同時(shí)，對(duì)挑治組、太寧栓組和正常組外周血指標(biāo)中IL-12和IFN-α含量進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，挑治組IL-12和IFN-α的含量均明顯高于太寧栓組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

綜上可以看出，挑治法對(duì)Ⅰ、Ⅱ期內(nèi)痔有較好的治療作用。推測(cè)其發(fā)揮作用的可能機(jī)制是通過(guò)挑治刺激作為抗原，直接作用或者進(jìn)一步誘導(dǎo)防御素的表達(dá)，調(diào)控TLR4-NF-κB相關(guān)通路發(fā)揮作用。