肖秀麗，唐明會

(上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 201999)

痔瘡(hemorrhoids)是一種常見病、多發(fā)病，在人群中的患病率為87.3%[1]。對于Ⅰ、Ⅱ期內痔可以通過非手術療法治療，筆者前期采用挑治療法治療Ⅰ、Ⅱ期內痔，收到較好的臨床療效，有效率達95.0%[2]，尤其對于便血、水腫和肛門墜脹感等癥狀的改善更具有優(yōu)勢。為進一步探討其作用機理，本文對不同組別的痔瘡患者及正?；颊咄庵苎猅oll樣受體4(TLR4)和核因子-κB(NF-κB) p65 mRNA表達及白細胞介素-12(IL-12)和干擾素-α(IFN-α)含量情況進行了觀察，現報告如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料

本研究共收集有完整記錄的觀察病例30例，來自上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結合醫(yī)院肛腸科2017年6月至2018年10月住院和門診患者，以及正常志愿者15例。按照隨機數字表法將患者隨機分為挑治組、太寧栓組。本研究經上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結合醫(yī)院倫理委員會批準。挑治組和太寧栓組患者性別、年齡、病程、痔瘡分類比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 診斷標準[3]

參照2006年7月中華醫(yī)學會外科學分會結直腸肛門外科學組、中華中醫(yī)藥學會肛腸病專業(yè)委員會、中國中西醫(yī)結合學會結直腸肛門病專業(yè)委員會修訂的《痔臨床診治指南(草案)》相關診斷。

1.3 納入標準

①符合上述診斷標準者;②年齡 18～65，男女不限;③近半月內未治療者;④簽署知情同意書者。

1.4 排除標準

①合并有其他肛門疾病者;②肛管、直腸有占位性病變者;③惡性腫瘤和精神病患者;④合并有嚴重心腦血管、肝、腎疾病及肝腎功能異常者;⑤合并血液系統疾病、自身免疫病、慢性嚴重感染、糖尿病及精神病患者;⑥合并有背部及全身性皮膚疾病患者;⑦妊娠期婦女。

1.5 剔除和脫落標準

①未按規(guī)定治療，無法判斷療效者;②治療過程中發(fā)生意外事件而不能堅持治療者;③治療過程中患者不配合治療者。

2 治療方法

2.1 挑痔組

采用痔點挑治法治療，每周1次，2次為1個療程。

2.2 太寧栓組

用太寧栓塞肛治療，每日1次，2周為1個療程。

2.3 正常組

不給予干預。

治療期間均停用其他相關治療藥物，忌食辛辣及刺激性食物。

3 治療效果

3.1 觀察指標

抽取3組靜脈血10 mL，4000 rpm離心5 min，取血清分裝待檢。5 d內檢測的標本于4℃冰箱保存，短期內無法檢測標本分裝后于-80℃低溫冰箱保存，避免反復凍融。

3.1.1 血清TLR4和NF-κB p65含量表達

采用熒光定量PCR法。①總RNA抽提，槍頭和離心管均經過濕熱滅菌且無RNA酶，取200 μL的全血加入800 μL的RNA提取液渦旋混合，加入250 μL三氯甲烷，顛倒離心管 15 s，充分混勻，靜置 3 min。4℃下12000 rpm離心10 min。將上清轉移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻。-20℃放置15 min。4℃下12000 rpm離心10 min，管底的白色沉淀即為RNA。吸除液體，加入75%乙醇1.5 mL洗滌沉淀。4℃下12000 rpm離心10 min。將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺上吹3 min。加入15 μL無RNA酶的水溶解 RNA。55℃孵育 5 min。使用 Nanodrop 2000檢測RNA濃度及純度，儀器空白調零后取2.5 μL待測RNA溶液于檢測基座上，放下樣品臂，使用電腦上的軟件開始吸光值檢測。將濃度過高的RNA進行適當比例的稀釋，使其終濃度為 200 ng/μL。②反轉錄，取一根PCR管，加入含 2 μg RNA的溶液。加入 1 μL oligo(dT)18。用無核糖核酸酶的去離子水補足至 12 μL。于PCR儀上65℃保溫5 min，迅速置冰上冷卻。依次加入 4 μL 5×buffer，2 μL 10 mM dNTPs，1 μL RNA inhibitor和 1 μL反轉錄酶，用槍抽吸混勻。于 PCR儀上42℃保溫60 min，結束后80℃保溫5 min滅活反轉錄酶。③定量PCR。取0.2 mL PCR管，配制如下反應體系，每個反轉錄產物配制 3管。2×qPCR Mix 12.5 μL 7.5 μM基因引物2.0 μL、反轉錄產物2.5 μL、ddH2O 8.0 μL。PCR擴增預變性95℃，10 min循環(huán)(40次)95℃，15 s→60℃，60 s 溶解曲線 75℃→95℃，每20 s升溫1℃。結果處理采用Δ Δ CT法，A=CT(目的基因，待測樣本)－CT(內標基因，待測樣本);B=CT(目的基因，對照樣本)－CT(內標基因，對照樣本);K=A－B;表達倍數=2-K。

3.1.2 血清IL-12和IFN-α含量表達

采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗人IL-12單抗和抗人單抗 IFN-α包被于酶標板上，標準品和樣品中的人 IL-12、IFN-α分別與單抗結合，加入生物素化的抗人IL-12和抗人IFN-α抗體，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入酶底物 OPD，出現黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492 nm處測OD值，人IL-12和IFN-α濃度與 OD值呈正比，可通過繪制標準曲線求出標本中人IL-12和TNF-α濃度。

3.2 療效標準

參照《上海市中醫(yī)病證診療常規(guī)》[4]，根據治療前后的癥狀積分，詳見表 2，按照療效指數將療效分為痊愈、顯效、有效、無效4個標準。療效指數(尼莫地平法)=[(治療前積分－治療后積分)/治療前積分]×100%。

痊愈:癥狀消失，痔核消失或全部萎縮。療效指數≥95%。

顯效:癥狀明顯改善，痔核縮小或萎縮不全，療效指數70%～94%。

有效:癥狀改善，痔核縮小，療效指數30%～69%。

無效:癥狀和體征均無明顯變化或變化不明顯，療效指數＜30%。

總有效率=[(痊愈例數＋顯效例數＋有效例數)÷總例數]×l00%。

表2 痔瘡癥狀積分

3.3 統計學方法

采用SPSS13.0 for Windows軟件統計分析數據。符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差表示，計量資料如服從正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用單因素方差分析;方差不齊，先校正方差，然后進行方差分析;計量資料不符合正態(tài)性檢驗，采用非參數檢驗。計數資料用率表示，采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3.4 治療結果

3.4.1 兩組臨床療效比較

挑治組治療后總有效率為 86.7%，顯著高于對照組的60.0%(P＜0.05)。詳見表3。

3.4.2 兩組臨床癥狀積分比較

挑治組患者出血、肛門墜脹、水腫癥狀積分明顯優(yōu)于太寧栓組，差異有統計學意義(P＜0.05)。兩組疼痛、脫出癥狀積分比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表4。

表3 兩組臨床療效比較 (例)

表4 兩組臨床癥狀積分比較 (±s，分)

表4 兩組臨床癥狀積分比較 (±s，分)

注:與太寧栓組比較1)P＜0.05

組別 例數 疼痛 出血 肛門墜脹 脫出 水腫挑治組 15 2.03±0.90 1.10±0.221) 1.57±1.101) 3.12±1.14 1.22±0.321)太寧栓組 15 1.90±0.84 3.70±0.55 3.26±0.73 2.97±0.89 3.78±0.73

3.4.3 3組血清TLR4和NF-κB p65表達比較

挑治組血清TLR4 mRNA擴增倍數明顯高于太寧栓組，差異有統計學意義(P＜0.05)，與正常組比較差異無統計學意義(P＞0.05);挑治組血清NF-κB p65 mRNA擴增倍數明顯高于太寧栓組，差異有統計學意義(P＜0.05)，與正常組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表5。

表5 3組血清TLR4和NF-κB p65表達比較 (±s)

表5 3組血清TLR4和NF-κB p65表達比較 (±s)

注:與太寧栓組比較1)P＜0.05

組別 例數 TLR4 NF-κB p65挑治組 15 4.04±2.831) 2.19±0.861)太寧栓組 15 1.09±1.48 0.81±0.85正常組 15 2.59±3.51 2.34±2.631)

3.4.4 3組血清IL-12和IFN-α含量比較

挑治組血清IL-12和IFN-α含量均明顯高于太寧栓組，差異有統計學意義(P＜0.05);與正常組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表6。

表6 3組血清IL-12和IFN-α含量比較 (±s，pg/mL)

表6 3組血清IL-12和IFN-α含量比較 (±s，pg/mL)

注:與太寧栓組比較1)P＜0.05;與正常組比較2)P＜0.05

組別 例數 IL-12 IFN-α挑治組 15 81.37±48.101) 31.93±7.111)太寧栓組 15 25.28±6.962) 16.73±4.622)正常組 15 69.98±9.19 25.54±4.60

4 討論

挑治法歷史悠久，起源于九針之后，民間流傳甚廣[5-6]。《針灸甲乙經》就記載有“痔痛攢竹主之;痔，會陰主之”。是運用三棱針在疾病反應點或穴位挑斷皮下纖維樣組織，以達通經活絡、調和氣血、瀉熱消腫之效而治療疾病的一種方法[7-8]。中醫(yī)學認為，挑治背部經脈能協調陰陽、行氣活血，而膀胱經別經過尾骶部，督脈又直通會陰，故挑治背部經脈上的痔點或穴位能達到治療痔瘡的目的[9]。

熊國華等[10-11]運用痔點挑治法配合拔罐治療內痔，治療組總有效率為82.69%。賈立剛[12]運用化痔洗劑結合穴位挑刺治療炎性及血栓性外痔 843例，治療組總有效率為91.93%。周岳松[13]運用痔點挑刺配合痔瘡栓直腸給藥治療痔瘡，治療組總有效率為95%。本研究觀察發(fā)現，挑治法治療Ⅰ、Ⅱ期內痔療效明顯優(yōu)于太寧栓治療組，與文獻報道研究結果一致。但目前的文獻研究中大多數只說明了治療后癥狀改善明顯，但忽略了局部體征變化這一重要療效評定標準。所以本試驗針對患者的癥狀體征進行了進一步的觀察，觀察發(fā)現，挑治組患者出血、肛門墜脹、水腫癥狀改善明顯，患者治療后癥狀積分改善明顯優(yōu)于太寧栓組。上述結果表明挑治法在改善Ⅰ、Ⅱ期內痔患者便血、痔瘡水腫和肛門墜脹感方面更具有優(yōu)勢。

痔瘡具有勞累時發(fā)作加重的典型特點，是中醫(yī)學“邪之所湊，其氣必虛”理論的體現。針刺刺絡療法在調整機體免疫功能方面具有優(yōu)勢[14]，可通過調節(jié)免疫細胞如T細胞亞群、吞噬細胞、自然殺傷細胞[15]，及T、B淋巴細胞和紅細胞等[16]，免疫分子如免疫球蛋白、細胞因子等，調節(jié)機體的免疫功能，既能使紊亂的免疫功能趨向正常，也能增強機體的抗病能力，是“正氣存內，邪不可干”理論的體現[17]。

Toll樣受體(TLR)是宿主細胞識別各種微生物致病成分的受體，能特異性地識別病原相關分子結構或體內的“危險信號”，誘導獲得性免疫。NF-κB位于TLR下游信號通路的樞紐位置，廣泛分布于免疫細胞，當細胞受到應激刺激后，NF-κB活化進入細胞核后，調節(jié)炎性細胞因子、細胞增殖(抗凋亡)等基因的轉錄，參與炎癥調節(jié)、淋巴細胞成熟、獲得性免疫的發(fā)生[18]。崔瑞等[19]研究發(fā)現當針刺產生的多種內源性危險信號作為配體與TLR4結合后，即可通過其介導的通路激活NF-κB，NF-κB 活化并轉位到胞核，啟動 IFN-α、IL-12等細胞因子的轉錄，使得 IFN-α、IL-12的分泌增多，單核細胞的分裂增殖增強，從而誘導機體的獲得性免疫機能。楊玉榮等[20]推測Gal-13是與TLR4結合來發(fā)揮作用;同時， Gal-13可促進單核細胞 NF-κB的活化，IL-12及 IFN-α炎癥介質的分泌，進而表現為促進單核細胞的增殖，促進細胞免疫功能。

本研究運用PCR法對挑治組、太寧栓組和正常組3組外周血中TLR4和NF-κB p65mRNA表達情況指標進行了檢測，發(fā)現挑治組TLR4 mRNA擴增倍數明顯高于太寧栓組，兩組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)，而與正常組比較差異無統計學意義(P＞0.05);挑治組NF- κB p65 mRNA擴增倍數明顯高于太寧栓組，兩組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)，而與正常組比較差異無統計學意義(P＞0.05);太寧栓組NF-κB p65擴增倍數明顯低于挑治組和正常組。同時，對挑治組、太寧栓組和正常組外周血指標中IL-12和IFN-α含量進行了檢測，檢測結果表明，挑治組IL-12和IFN-α的含量均明顯高于太寧栓組，兩組比較差異具有統計學意義(P＜0.05);而與正常組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。檢測結果與文獻報道基本一致。

綜上可以看出，挑治法對Ⅰ、Ⅱ期內痔有較好的治療作用。推測其發(fā)揮作用的可能機制是通過挑治刺激作為抗原，直接作用或者進一步誘導防御素的表達，調控TLR4-NF-κB相關通路發(fā)揮作用。