王玉霞 孟利強(qiáng) 李 晶 姜 威劉宇帥 曹 旭 張淑梅

(1黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江 哈爾濱 150010；2黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江 哈爾濱 150020)

芽胞桿菌類微生物制劑具有藥肥雙效、環(huán)境友好特性，是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保障。 芽胞桿菌在土壤中的繁殖能力與防效呈正相關(guān)，低溫條件下菌株生長緩慢，防效下降，限制了其在低溫環(huán)境中的應(yīng)用[1]。近年來，國內(nèi)相繼開展了低溫芽胞桿菌的研究，主要側(cè)重于菌株篩選和生防效果方面[2-5]，對其低溫生長機(jī)制的研究較少。

微生物的低溫適冷機(jī)制涉及細(xì)胞全局性反應(yīng)，包括營養(yǎng)吸收、基因表達(dá)、蛋白合成、能量代謝、細(xì)胞分裂等復(fù)雜過程，目前多集中于細(xì)胞膜、適冷酶和冷休克蛋白等方面[6-8]。 微生物在低溫條件下可通過增加不飽和脂肪酸及支鏈脂肪酸的含量，降低脂肪酸鏈長度來提高細(xì)胞膜流動性，完成營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收[9]。此外，低溫條件下微生物可產(chǎn)生低溫酶及Csps 系列冷激蛋白提高其穩(wěn)定性及生物活性[10-11]。 基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等組學(xué)技術(shù)為微生物低溫適冷機(jī)制研究提供了新方法。 Ting 等[12]通過蛋白質(zhì)組技術(shù)發(fā)現(xiàn)菌株Sphingopyxis alaskensis冷適應(yīng)涉及生理代謝多個層面；Wang 等[13]通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)sychrobactersp.低溫響應(yīng)脂肪酸和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體代謝相關(guān)基因差異表達(dá)。 目前多數(shù)研究側(cè)重于應(yīng)用組學(xué)技術(shù)研究微生物低溫短暫應(yīng)答機(jī)制[14-16]，對微生物低溫長期生長機(jī)制的研究較少。

菌株WM7 是黑龍江省科學(xué)院微生物研究所微生物藥物團(tuán)隊前期利用等離子體誘變技術(shù)獲得的一株低溫生長速度較快的甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌[17]，該菌株抑菌譜廣，具有一定的開發(fā)應(yīng)用潛力。 本研究利用高通量測序技術(shù)對該菌株進(jìn)行低溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組分析，挖掘其低溫生長相關(guān)基因，以期為揭示該菌株低溫生長分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌(Bacillus methylotrophicus)WM7 是一株采用等離子體誘變技術(shù)獲得的生防菌株，遺傳穩(wěn)定性好，低溫生長速度快，可抑制多種植物病原菌生長，保存于黑龍江省生物工程重點實驗室。

1.2 菌株培養(yǎng)

取一環(huán)冷凍保藏的WM7 菌液接種到LB 固體平板上，30℃過夜培養(yǎng)，次日取單菌落轉(zhuǎn)接于5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，30℃條件下170 r·min-1震蕩培養(yǎng)1 d，按2%接種量轉(zhuǎn)接于500 mL LB 液體培養(yǎng)基中，分別置于30℃和15℃震蕩培養(yǎng)1 d，離心收集菌體并于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA 提取與文庫構(gòu)建

采用TRNzol Reagent 試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取總RNA，經(jīng)2100 Bioanalyzer(安捷倫，美國) 質(zhì)檢合格后，用Ribo-ZeroTMMagnetic Kit(Epicentre，美國)去除rRNA，取100 ng 樣品用NEB Next ? UltraTMDirectional RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB，美國) 構(gòu)建文庫，經(jīng)Qubit 定量、2%瓊脂糖凝膠電泳及High sensitivity DNA chip 檢測合格后，取10 ng 樣品用Illumina HiseqTM2500/MiSeqTM進(jìn)行雙向測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)分析

使用q20 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)去除原始數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量數(shù)據(jù)，用Bowite 2 v2.1.0 軟件將Clean reads 分別比對到參考基因組和參考基因序列中，用Samtools v0.1.19軟件進(jìn)行表達(dá)水平分析，基因表達(dá)量的計算使用RPKM 法；利用DEGseqv1.20.0 程序包中的MARS 模型進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，同時滿足倍數(shù)變化(Fold change)＞2、FDR(q 值)＜0.001、P≤0.05、至少一個樣本RPKM＞20 的基因為差異表達(dá)顯著基因。 將差異表達(dá)基因在GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行功能和代謝途徑注釋，根據(jù)差異基因的GO 和KEGG pathway 注釋信息，對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 和KEGG pathway 富集分析，以確定差異表達(dá)基因顯著性富集的GO 功能分類和生化代謝途徑。

1.5 差異基因RT-qPCR 驗證

選取6 個低溫響應(yīng)差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR驗證。 用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix[天根生化科技(北京)有限公司]試劑盒進(jìn)行菌體總RNA提取和cDNA 合成，利用primer 5.0 軟件設(shè)計RTqPCR 引物，以菌體16S rRNA 作內(nèi)參計算基因的相對表達(dá)量。 各處理均做3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組與參考基因組比對

由表1 可知，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫和常溫培養(yǎng)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的有效reads 分別為3 523 063和3 009 005，q20 均為99.62%，這些reads 與參考基因組(甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌CBMB205)基因匹配程度較高，匹配率分別為81.5%和79.5%，能夠比對到基因組多個位置的Multiple match 比例較低，僅能夠比對到基因組唯一位置的Unique match 大于75%，可信度較高，說明測序質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析。

表1 兩樣品與參考基因組比對結(jié)果Table 1 RNA-Seq data quality of two samples compared with reference genome

2.2 基因表達(dá)量分析

由表2 可知，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 的低溫和常溫培養(yǎng)樣品的基因表達(dá)量分布一致，RPKM 在10～1 000 范圍內(nèi)的基因最多(73.5%和70.6%)，其次是RPKM＜10 的基因(19.3%和22.9%)，RPKM＞1 000 的基因較少(0.7%和0.6%)。

2.3 差異表達(dá)基因分析

轉(zhuǎn)錄組測序顯示，有3 758 個基因差異表達(dá)，表達(dá)量變化2～5 倍、5 ～10 倍、10 ～15 倍和大于15 倍的基因數(shù)分別為45.2%、13.9%、3.5%和6.3%，其中，2 029 個基因差異表達(dá)顯著，低溫條件下1 519 個基因表達(dá)上調(diào)，510 個基因表達(dá)下調(diào)，上調(diào)基因是下調(diào)基因的2.9 倍。 基因表達(dá)差異程度不均一，差異倍數(shù)在2 ～5倍的基因最多(65.4%)，其次是差異倍數(shù)5 ～10 倍和大于15 倍的基因，分別為25.87%和11.68%，差異倍數(shù)10～15 倍的基因最少(6.45%)。 差異倍數(shù)2～10 倍的上調(diào)基因是下調(diào)基因的2.5 倍，差異倍數(shù)10 ～15 倍的上調(diào)基因略多于下調(diào)基因，差異倍數(shù)大于15 倍下調(diào)基因是上調(diào)基因的2 倍(圖1)。

表2 不同表達(dá)水平(RPKM)范圍分布的基因數(shù)Table 2 The number of genes distributed in different expression levels (RPKM)

圖1 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫響應(yīng)差異表達(dá)基因統(tǒng)計分析Fig.1 Statistical analysis of differentially expressed genes of Bacillus methylotrophicus WM7 at low temperature

2.4 差異表達(dá)顯著基因的GO 功能和KEGG 分析

GO 功能注釋了1 199 個基因，歸屬于細(xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物過程(biological process)3 個部分(圖2)。 低溫條件下，941 個基因上調(diào)表達(dá)，258 個基因下調(diào)表達(dá)。 低溫響應(yīng)上調(diào)表達(dá)基因主要與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)菌趨化、脂肪酸合成、膜蛋白、能量代謝和冷適應(yīng)酶等相關(guān)；下調(diào)表達(dá)基因主要與孢子形成、氧化還原作用、蛋白裂解及壓力應(yīng)答相關(guān)。 KEGG 分析顯示，683 個差異表達(dá)基因參與到四大類20 個小類代謝通路中，其中與糖類、蛋白(含氨基酸)、脂類和核酸等四類生物大分子代謝相關(guān)的基因占差異表達(dá)基因總量的58.9%，能量代謝相關(guān)基因占9.3%，細(xì)胞運(yùn)動相關(guān)基因占9.3%，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因占22.9%(圖3)。 KEGG 顯著富集到37個代謝途徑，其中嘌呤和嘧啶代謝、細(xì)菌趨化、氨基酸合成、鞭毛組裝、磷酸戊糖途徑涉及的基因數(shù)最多。 定位到磷酸戊糖途徑有25 個基因，24 個上調(diào)表達(dá)。 定位到嘌呤代謝途徑有66 個基因，39 個上調(diào)表達(dá)。 定位到嘧啶代謝途徑有47 個基因，35 個上調(diào)表達(dá)。 定位到細(xì)菌趨化途徑和鞭毛合成途徑分別有15 個和29個基因，均上調(diào)表達(dá)。 定位到氨基酸合成途徑有120個基因，84 個上調(diào)表達(dá)。 以上注釋信息為研究甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫生長調(diào)控機(jī)制提供了必要的基因分子信息。

圖3 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫響應(yīng)差異表達(dá)基因KEGG 代謝通路分類Fig.3 KEGG pathway categories of differentially expressed genes of Bacillus methylotrophicus WM7 at low temperature

2.5 脂肪酸合成與膜蛋白相關(guān)基因

細(xì)胞膜是細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行信息、物質(zhì)與能量交換的重要場所。 微生物低溫下可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂組成維持膜的流動性，增加不飽和脂肪酸含量，縮短脂肪酸鏈長度。 由表3 可知，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫響應(yīng)25 個脂肪酸代謝相關(guān)基因差異表達(dá)，參與脂肪酸分解代謝的7 個基因中5 個下調(diào)表達(dá)，2 個上調(diào)表達(dá)，其中乙酰-CoA 乙酰轉(zhuǎn)移酶(NG74＿RS15160)、脂酰輔酶A 水合酶(NG74＿RS 13010)、乙酰-CoA 乙酰轉(zhuǎn)移酶(NG74＿RS 11340)和3-羥?；?輔酶A 脫氫酶(NG74＿RS 15165)4 個基因低溫響應(yīng)顯著下調(diào)表達(dá)。參與脂肪酸合成代謝的18 個基因中編碼β 酮脂酰ACP 合成酶Ⅱ(NG74＿RS02805)、乙酰CoA 羧化酶(NG74＿RS09255)、長鏈脂肪酸CoA 連接酶(NG74＿RS05145)基因下調(diào)表達(dá)，編碼脂肪酸合酶系統(tǒng)的accA、accB、accC、accD、fabD、fabH、fabI、fabZ、fabG、fabL、fabF、MCH和Δ12-脂肪酸脫飽和酶基因均上調(diào)表達(dá)。

細(xì)胞膜膜蛋白在物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜結(jié)構(gòu)與功能維持等方面具有重要作用，膜蛋白和膜脂相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫響應(yīng)46 個膜蛋白基因上調(diào)表達(dá)，19 個膜蛋白基因下調(diào)表達(dá)，上調(diào)的膜蛋白主要與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)結(jié)合和膜結(jié)構(gòu)維持相關(guān)，其中參與多糖生物合成基因NG74＿RS15990 上調(diào)表達(dá)幅度最大(9.49 倍)。

2.6 膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因

ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體是一組跨膜蛋白，是細(xì)菌質(zhì)膜上的一種運(yùn)輸ATP 酶，用來轉(zhuǎn)運(yùn)營養(yǎng)物質(zhì)。 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫響應(yīng)下68 個ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體基因差異表達(dá)，其中48 個上調(diào)，20 個下調(diào)，上調(diào)表達(dá)基因與核酸、糖類、甘氨酸、含硫氨基酸、金屬離子、維生素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，下調(diào)表達(dá)基因與多肽、谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。 多數(shù)基因差異表達(dá)2～5 倍，少數(shù)基因差異表達(dá)倍數(shù)較高，包括谷氨酰胺ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)滲透酶基因NG74＿RS12455 和NG74＿RS12460下調(diào)9 倍和85 倍，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)滲透酶基因NG74＿RS15005下調(diào)229 倍，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合蛋白YxeB 基因NG74＿RS18535 上調(diào)14 倍，甘氨酸ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)底物結(jié)合蛋白基因NG74＿RS15805 上調(diào)8.6 倍。

細(xì)菌通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實現(xiàn)對環(huán)境信號的應(yīng)答，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫響應(yīng)下雙組分系統(tǒng)、FoxO、磷脂酰肌醇、MAPK、HIF-1、AMPK 和PI3K-Akt 7 個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的70 個基因差異表達(dá)，涉及雙組分信號系統(tǒng)基因最多(58 個)，其中與趨化、鞭毛運(yùn)動、DNA 結(jié)合應(yīng)答調(diào)控、組氨酸激酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、碳儲存調(diào)控、檸檬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)、染色體復(fù)制起始、RNA 聚合酶sigD因子、蘋果酸酶等相關(guān)的53 個基因上調(diào)表達(dá)，其他途徑中除了FoxO 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因下調(diào)表達(dá)外，磷脂酰肌醇、MAPK、HIF-1、AMPK 和PI3K-Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因均上調(diào)表達(dá)。 多數(shù)基因差異表達(dá)倍數(shù)為2 ～10 倍，9 個基因差異表達(dá)倍數(shù)大于10 倍，包括FoxO 信號途徑中的過氧化氫酶基因NG74＿RS18240 和超氧化物歧化酶基因NG74＿RS18240 下調(diào)17.9 倍和20.5倍，雙組分信號系統(tǒng)中的乙酰輔酶A ?；D(zhuǎn)化酶基因NG74＿RS11340 下調(diào)78.7 倍，雙組分信號系統(tǒng)途徑中的組氨酸激酶傳感器基因NG74＿RS01280，抗穴蛋白基因NG74＿RS13180，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NG74＿RS01285，NDA 結(jié)合響應(yīng)調(diào)控因子NG74＿RS13190 和NG74＿RS18560 以及胞壁酸水解酶調(diào)控因子NG74＿RS13185分別上調(diào)18.5 倍、18.1 倍、12.0 倍、15.1 倍、17.4 倍和66.0 倍。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是細(xì)胞受環(huán)境影響調(diào)控特定基因表達(dá)的重要因子[18]。 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫響應(yīng)下93 個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因差異表達(dá)，包括MarR、DeoR、RpiR、 NrdR、 HxlR、 ArsR、 AsnC、 PucR、 TetR、AraC、GntR、RuBisCO、LysR、LacI、Rrf2、MerR、PadR、MntR 和Fis 家族的53 個基因和40 個其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，只有7 個轉(zhuǎn)錄因子基因下調(diào)表達(dá)，包括1 個LysR、1 個MerR 和1 個TetR 轉(zhuǎn)錄因子，其他轉(zhuǎn)錄因子均上調(diào)表達(dá)。 13 個基因差異表達(dá)倍數(shù)大于10 倍，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NG74＿RS15950 和NG74＿RS16045 及產(chǎn)孢轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NG74＿RS17 090 分別表達(dá)下調(diào)144.9 倍、18.6 倍和58.6 倍，HxlR、ArsR、AsnC、MarR、Fis、XRE和LysR 家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NG74＿RS01680、NG74＿RS19060、NG74 ＿RS02080、NG74 ＿RS03545、NG74 ＿RS04130、 NG74＿RS11305、NG74＿RS17480 和NG74＿RS01740 分別表達(dá)上調(diào)36.0 倍、11.7 倍、34.3 倍、15.0 倍、40.5 倍、16.8 倍、15.3 倍和13.4 倍，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NG74＿RS16925、NG74＿RS18195 和NG74＿RS06 005 分別表達(dá)上調(diào)26.6 倍、15.0 倍和13.1 倍(表3)。

2.7 適冷酶及冷適應(yīng)蛋白相關(guān)基因

產(chǎn)生適冷酶和冷適應(yīng)蛋白是菌株低溫適應(yīng)的重要機(jī)制之一。 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫響應(yīng)下碳氮代謝中的一些酶和冷適應(yīng)蛋白基因差異表達(dá)。 參與碳代謝的三羧酸循環(huán)途徑中的13 個酶基因上調(diào)表達(dá)2.5 ～17.6 倍，3 個關(guān)鍵酶:檸檬酸合成酶NG74＿RS13300、異檸檬酸脫氫酶NG74＿RS13295 和α 酮戊二酸脫氫酶NG74＿RS04 035 分別上調(diào)2.8 倍、3.0 倍和2.5 倍，琥珀酸輔酶A 連接酶NG74＿RS07975 和NG74＿RS07980 上調(diào)表達(dá)顯著，分別上調(diào)9.5 倍和17.6 倍。 參與磷酸戊糖途徑的20 個酶基因上調(diào)表達(dá)2.8～13.4 倍，其中葡糖糖酸激酶NG74＿RS15920、6-磷酸己酮糖異構(gòu)酶NG74＿RS01670、葡萄糖6 磷酸脫氫酶NG74＿RS11195、核糖激酶NG74＿RS16835 和6 磷酸葡萄糖酸脫氫酶NG74＿RS11200 基因上調(diào)表達(dá)顯著，分別上調(diào)10.6 倍、13.4 倍、11.6 倍、8.12 倍和8.8倍。 參與糖酵解途徑的ATP 依賴型6-磷酸果糖激酶NG74＿RS13340、葡萄糖6 磷酸異構(gòu)酶NG74＿RS14405、磷酸甘油酸酯激酶NG74＿RS15865 基因分別上調(diào)4.5倍、4.7 倍和2.2 倍。 參與氮代謝的谷氨酸脫氫酶基因NG74＿RS10670 和NG74＿RS17770 分別上調(diào)6.8 倍和231.1 倍，參與氨基酸代謝的天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶基因NG74＿RS07670 上調(diào)248 倍。 參與DNA 復(fù)制與修復(fù)的RNA 聚合酶基因NG74＿RS04785 與RNA 解旋酶基因NG74＿RS03670 均上調(diào)4.4 倍。 冷適應(yīng)蛋白NusA(NG74＿RS08235)和NusG(NG74＿RS11155)、RecA(NG74＿RS08405)、IF-2(NG74＿RS08250)、Hpr(NG74＿RS16345)、半光氨酸合成酶(NG74＿RS12360)和磷酸丙糖異構(gòu)酶基因(NG74＿RS15860)上調(diào)表達(dá)2.5～13.7 倍(表3)。 以上適冷酶和冷適應(yīng)蛋白基因上調(diào)表達(dá)，可提高酶在低溫條件下的催化效率和蛋白活性，維持菌體細(xì)胞正常的生命活動，增強(qiáng)菌株低溫適應(yīng)性。 此外，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)397 個未知功能蛋白基因差異表達(dá)，其中11 個基因差異表達(dá)大于50 倍。

2.8 差異表達(dá)基因的RT-qPCR 驗證

6 個差異表達(dá)顯著基因NG74＿RS02480(Δ12-脂肪酸脫飽和酶)、NG74＿RS13300(檸檬酸合成酶)、NG74＿RS15920(葡萄糖酸激酶)、NG74＿RS10670(谷氨酸脫氫酶)、NG74＿RS0825(轉(zhuǎn)錄起始因子IF-2)和NG74＿RS08235(轉(zhuǎn)錄終止因子NusA)的RT-qPCR 結(jié)果與表達(dá)譜分析的表達(dá)變化趨勢相同，但表達(dá)差異倍數(shù)存在差異(圖4)，說明基因表達(dá)譜的分析結(jié)果可靠。

3 討論

溫度是影響細(xì)菌生長的重要因素之一，細(xì)菌的冷適應(yīng)涉及細(xì)胞膜、酶和蛋白，碳氮及能量代謝，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多方面的變化。 轉(zhuǎn)錄組能夠從整體水平上研究基因功能及結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學(xué)過程中的分子機(jī)理[19]，已被用于細(xì)菌冷適應(yīng)分子機(jī)制的研究。Wang 等[13]對菌株Antarctic psychrotrophic低溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，大量轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體和脂肪酸代謝相關(guān)基因差異表達(dá)。 Phadtare 等[20]對大腸桿菌冷脅迫下的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，大量的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和能量代謝基因差異表達(dá)。 本研究首次對甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 進(jìn)行低溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)2 029個(53.9%)基因低溫響應(yīng)差異表達(dá)，其中上調(diào)基因是下調(diào)的3 倍，GO 功能注釋了1 199 個(59.0%)基因，683 個(56.9%)基因參與KEGG 代謝，大量與代謝、細(xì)胞運(yùn)動、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 復(fù)制與基因修復(fù)相關(guān)的基因差異表達(dá)，分布在20 個小類代謝途徑中，其中531 個基因表達(dá)上調(diào)，152 個基因表達(dá)下調(diào)，說明該菌株低溫響應(yīng)是由多基因參與的系統(tǒng)調(diào)控過程。

細(xì)胞膜是細(xì)菌重要的溫度敏感元件，低溫脅迫下可通過提高細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量以維持膜的流動性。 不飽和脂肪酸由2 種途徑合成，一種是由短鏈飽和脂肪酸在一系列的脂肪酸延長酶與脂肪酸脫飽和酶交替作用下合成；另一種是通過PKS 酶系合成，包括酮脂酰ACP 合成酶、酮脂酰ACP 還原酶、烯脂酰ACP脫水酶和烯脂酰ACP 還原酶[21-22]。 本試驗結(jié)果表明，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫響應(yīng)下大量脂肪酸代謝相關(guān)基因差異表達(dá)，其中不飽和脂肪酸合成相關(guān)酶基因，包括Δ12-脂肪酸脫飽和酶、烯脂酰ACP 還原酶fabI 和fabL、β-酮脂酰ACP 還原酶、烯脂酰ACP脫水酶、3-酮脂酰ACP 還原酶和3-酮脂酰ACP 合成酶基因均上調(diào)表達(dá)，說明甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7低溫下提高了不飽和脂肪酸合成能力，可通過增加細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量來穩(wěn)定細(xì)胞膜功能，使其在低溫條件下能夠正常生長繁殖。

細(xì)菌低溫下基因表達(dá)模式的改變因菌株而異，大腸桿菌在冷脅迫下參與糖酵解、三羧酸循環(huán)、氨基酸合成途徑的一些酶基因的表達(dá)被抑制[20]。 而本研究中，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫響應(yīng)下參與碳氮和氨基酸代謝的一些酶基因上調(diào)表達(dá)， 推測該菌株在低溫條件下可通過提高細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝來維持菌株的快速生長。 冷適應(yīng)蛋白參與轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白折疊等各種代謝活動，CspS 系列冷適應(yīng)蛋白廣泛存在于枯草芽胞桿菌、大腸桿菌等細(xì)菌中，低溫條件下高表達(dá)[23-24]，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫響應(yīng)下未發(fā)現(xiàn)這類蛋白差異表達(dá)，說明這類蛋白對該菌株低溫生長的影響不顯著。

磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑是細(xì)菌中普遍存在的葡萄糖降解途徑，磷酸戊糖途徑可以產(chǎn)生大量的NADPH，為細(xì)胞的各種合成反應(yīng)提供還原劑，其中間產(chǎn)物是許多物質(zhì)(核苷酸、芳香族氨基酸等)的合成原料。 糖酵解途徑產(chǎn)生ATP 和丙酮酸，為細(xì)胞活動提供能量。 三羧酸循環(huán)是生物體利用糖、脂肪、蛋白等物質(zhì)氧化獲得能量的重要途徑，其代謝中間產(chǎn)物與其他代謝途徑發(fā)生聯(lián)系和相互轉(zhuǎn)變。 本試驗中，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫響應(yīng)下磷酸戊糖途徑中24 個基因上調(diào)表達(dá)，其關(guān)鍵酶基因——葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因上調(diào)12 倍；糖酵解途徑中3 個關(guān)鍵酶基因(ATP 依賴型6-磷酸果糖激酶、葡萄糖6 磷酸異構(gòu)酶、磷酸甘油酸酯激酶)上調(diào)表達(dá)，三羧酸循環(huán)中13 個基因上調(diào)表達(dá)，說明菌株WM7 低溫響應(yīng)下可通過強(qiáng)化磷酸戊糖途徑、糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)為其生長提供能量和物質(zhì)。

本試驗結(jié)果表明，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫響應(yīng)下大量ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子相關(guān)基因差異表達(dá)，且多數(shù)上調(diào)，推測菌株WM7感受低溫刺激后增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)能力，以維持菌株低溫快速生長需求。 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體基因差異表達(dá)是細(xì)菌低溫響應(yīng)的共性體現(xiàn)，F(xiàn)lavobacterium psychrophilum[25]和Antarctic psychrotrophic[13]低溫脅迫下ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體基因也差異表達(dá)，涉及的基因數(shù)量低于甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7。 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子中涉及最多的是雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，其中有13 個細(xì)菌趨化因子基因上調(diào)表達(dá)。 細(xì)菌趨化是細(xì)胞最基本的生理反應(yīng)[26]，對細(xì)菌趨利逐弊十分重要[27-28]。 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫響應(yīng)下細(xì)菌趨化和鞭毛合成途徑中包括組氨酸蛋白激酶CheA、跨膜的甲基化受體趨化蛋白MCP、CheY-P 特異磷酸酶CheC、趨化蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶CheR、嘌呤結(jié)合蛋白CheW、趨化蛋白調(diào)控因子CheV、化學(xué)感受器谷氨酰胺脫氨酶CheW 和鞭毛運(yùn)動蛋白Mot A/B 等44 個基因均上調(diào)表達(dá)，說明菌株WM7 低溫下其趨化活性增強(qiáng)，利于其攝取營養(yǎng)物質(zhì)，增強(qiáng)低溫適應(yīng)性。 菌株WM7 趨化系統(tǒng)中除了調(diào)控因子CheV，其他趨化因子與大腸桿菌趨化系統(tǒng)一致[29-31]，該調(diào)控因子的具體功能有待進(jìn)一步研究。 此外，本研究發(fā)現(xiàn)較多表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)15 倍以上的未知功能基因，說明甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 低溫響應(yīng)還存在其他調(diào)節(jié)機(jī)制，對于這些基因的低溫應(yīng)答機(jī)制目前還是空白，后續(xù)需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù)對生防菌株甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WM7 進(jìn)行低溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)2 029 個差異表達(dá)基因，其中1 519 個低溫上調(diào)，510 個低溫下調(diào)。 GO 和KEGG 分析明確了菌株低溫響應(yīng)主要與脂肪酸代謝、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳氮代謝相關(guān)。 RT-qPCR 分析表明，6 個差異表達(dá)顯著基因表達(dá)特點與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。 本研究結(jié)果為全面揭示菌株WM7 低溫生長機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)并提供了基因信息。