于云寶，林芷伊，滿 洋，苗 章，朱東陽，張宏偉*，彭心宇*

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院1 肝膽外科，2 腫瘤科，石河子 832008)

肝臟是人體最大的實質性消化器官，具有非常重要的生理功能。臨床上多種原因能引起肝臟損傷，如手術、創(chuàng)傷、感染、壞死等，肝臟受到損傷后，殘存的正常肝組織能夠通過再生，迅速恢復至原有的體積和重量，最終實現(xiàn)肝組織結構的重建及肝功能的恢復[1]。干細胞移植技術是近20 多年來出現(xiàn)的新興技術，具有良好的促進組織修復和再生的能力，已被廣泛應用于各種臨床慢性損傷性疾病的初級研究中。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種從中胚層和外胚層衍生出的多能干細胞，具有多項分化的潛能[2]。有研究[3]表明，將臍血來源的MSCs 移植入肝硬化大鼠的肝臟內，發(fā)現(xiàn)植入的MSCs 可以分化成為肝細胞。也有研究[4-7]證實，骨髓MSCs 能夠直接分化為肝細胞，從而促進肝臟再生。

我們近期的研究[8]發(fā)現(xiàn)，MSCs 和內皮前體細胞(endothelial precursor cells,EPCs)之間有著非常密切的聯(lián)系，EPCs 對MSCs 的自我更新及成骨、成軟骨、成脂等分化均有一定的促進作用，因此推測EPCs 可能是MSCs 的支持細胞。另肝血竇的內皮細胞可以促進肝細胞的增殖[9]。因此，本研究擬探討EPCs 在MSCs 向肝樣細胞轉化中是否也起到了促進作用，為今后干細胞聯(lián)合移植提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD 大鼠20 只，雌雄不限，4～6 周齡，體質量100～150 g，購自新疆烏魯木齊市疾病預防控制中心，實驗經石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會討論批準。

1.1.2 主要試劑和儀器 L-DMEM 培養(yǎng)基、EGM-2 MV BulletKit(CC-3156&CC-4147)、胎牛血清、青鏈霉素、胰酶(Hyclone 公司,美國)；肝細胞生長因子、成纖維細胞生長因子-4、內皮生長因子(Peprotech 公司,美國)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)、地塞米松、1×細胞培養(yǎng)添加物(insulin、transferrin、selenium,ITS)、DAPI(Sigma 公司,美國)；0.1%Gelatin-Solution 明膠(北京索萊寶生物公司)；Trizol(Invitrogen公司,美國)；兔抗大鼠甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)抗體1∶200 稀釋，兔抗大鼠清蛋白(albumin,ALB)抗體，1∶100 稀釋(Abcam 公司,美國)；山羊抗兔FITC標記二抗，1∶100 稀釋(購至北京中杉金橋生物公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo 公司,美國)；熒光倒置顯微鏡(Leica 公司,德國)；低速離心機(Bio-Rad 公司)、超凈工作臺(Thermo 公司)、冰箱(海爾公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離、培養(yǎng)及鑒定 鼠骨髓來源MSCs和EPCs 的分離、培養(yǎng)及鑒定按本實驗室前期的方法進行[10]，將細胞培養(yǎng)至第3 代備用。

1.2.2 肝細胞轉化培養(yǎng)基的配制 α-MEM：10%胎牛血清(fetal calf serum,FBS)，10-7 μmol/L 地塞米松，1×ITS，20 ng/mL 肝細胞生長因子，20 ng/mL 成纖維細胞生長因子-4,20 ng/mL 內皮生長因子。

1.2.3 培養(yǎng)過EPCS 的無血清及因子的培養(yǎng)基(endothelial progenitor cell-conditioned medium,EPCs-CM)的提取 取第3 代EPCs，當細胞融合度達80%～90%時，吸走完全培養(yǎng)基，PBS 沖洗2 遍，吸盡PBS，加入不含血清及因子的空培養(yǎng)基，放入37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2恒溫箱培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h 后，吸取培養(yǎng)基EPCs-CM 備用。

1.2.4 誘導MSCs 向肝樣細胞的分化 MSCs 的培養(yǎng)分為3組。(1)實驗組：使用EPCs-CM，與肝細胞轉化培養(yǎng)基按1∶1 的比例培養(yǎng)MSCs；(2)模型對照組：無血清的α-MEM 與肝細胞轉化培養(yǎng)基按1∶1 比例培養(yǎng)MSCs；(3)空白對照組：正常α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs。提前24 h 用0.1%明膠包被6 孔板，第3代SD 大鼠MSCs 用胰酶消化后，按照2×104/cm2的細胞密度接種于6 孔板中，每孔加入含體積分數(shù)為10%胎牛血清的低糖培養(yǎng)基(low glucose dulbecco′s modified eagle media,L-DMEM)，放入37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2恒溫箱培養(yǎng)，當細胞融合度達到40%～50%時，吸走完全培養(yǎng)基，3組分別加入對應培養(yǎng)基，放入細胞恒溫箱進行培養(yǎng)，每3 d 換液1 次。觀察細胞形態(tài)變化，并于誘導分化的3、5、7、9 d 收集細胞鑒定肝樣細胞的特異性標志AFP、ALB。

1.2.5 細胞ALB、AFP 免疫熒光化學檢測 將誘導3、5、7、9 d 的細胞用4%多聚甲醛室溫固定10 min；PBS 37 ℃預溫處理，清洗2 min×3 次；0.2%的Trition X-100 對細胞進行透化處理10 min；用PBS 清洗2 min×3 次；分別加入兔抗大鼠AFP 抗體(1∶200)和兔抗大鼠ALB 抗體(1∶100)，置于濕盒，4 ℃過夜；次日，37 ℃復溫30 min，PBS 清洗2 min×3 次；暗室中加入山羊抗兔FITC 標記二抗(1∶100)，避光孵育60 min；PBS洗3 min×4 次；DAPI 染核30 s；吸除多余DAPI，PBS洗3 min×4 次；用熒光顯微鏡觀察后拍照。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s 表示，采用兩因素重復測量方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 細胞形態(tài)的觀察 光鏡下顯示MSCs 剛接種時多呈類圓形或橢圓形，約5 h 貼壁呈紡錘形，24 h內細胞體積增大，部分貼壁細胞開始分裂增殖。48 h后，貼壁細胞出現(xiàn)棒狀、梭形、三角形等多形態(tài)樣改變。第3～5 天，實驗組和模型對照組細胞開始聚集，生長速度放緩，出現(xiàn)多核的成纖維樣細胞，呈梭形或多邊形改變，實驗組比模型對照組出現(xiàn)形態(tài)變化的細胞數(shù)量多；空白對照組細胞生長速度未見變化，形態(tài)亦出現(xiàn)改變。第7～9 天，實驗組和模型對照組細胞開始形成小梁樣結構，細胞體積變大，呈多角形或梭形，胞漿豐富，可見多核，細胞生長速度變慢；實驗組比模型對照組出現(xiàn)形態(tài)變化的細胞數(shù)量多，且出現(xiàn)小梁樣結構時間早；空白對照組細胞生長速度未見變化，形態(tài)亦出現(xiàn)改變，見圖1。

2.2 AFP 免疫熒光檢測結果 MSCs 培養(yǎng)第3 天，實驗組和模型對照組的AFP 免疫熒光染色即出現(xiàn)陽性染色，且染色強度和染色細胞數(shù)量均隨時間延長逐漸增加；空白對照組在第3、5、7、9 天均未見免疫熒光染色。實驗組AFP 濃度在第3、5、7、9 天明顯高于模型對照組；模型對照組和實驗組的AFP 濃度在第3、5、7、9 天均不全相同，并隨著時間推移均呈上升趨勢(圖2，見封三)。

2.3 AFP 免疫熒光半定量數(shù)據(jù)檢驗 通過對學生化殘差的分析，經Shapiro-Wilk 檢驗，實驗組和模型對照組AFP 濃度數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布(P＞0.05)；通過學生化殘差是否超過±3 倍的標準差判斷，各組數(shù)據(jù)無異常值，見圖3。

2.4 AFP 半定量數(shù)據(jù)分析 干預因素和時間的交互作用對AFP 的濃度的影響有統(tǒng)計學意義。模型對照組和實驗組在不同時間點AFP 濃度均不全相同(P＜0.05)，且隨著時間推移兩組AFP 的濃度均呈上升趨勢(P＜0.05)。在不同時間點實驗組AFP 濃度均高于模型對照組(P＜0.05)，見圖4、表1。

2.5 ALB 免疫熒光檢測結果 MSCs 培養(yǎng)第7、9天，實驗組的ALB 免疫熒光染色出現(xiàn)陽性染色，且染色強度和染色細胞數(shù)量均隨時間增長逐漸增加；空白對照組和模型對照組在第3、5、7、9 天均未見免疫熒光染色，見圖5(見封三)。

3 討 論

MSCs是一種成體干細胞，來源于胚胎發(fā)育早期的中胚層和外胚層，主要來源于骨髓，屬于多能干細胞，具有多向分化增殖潛能[2]、自我更新、自我復制、免疫調控[11]等特點，在特定的誘導條件可分化為肝樣細胞、心肌樣細胞、胰島樣細胞、神經樣細胞、軟骨樣細胞、骨樣細胞、脂肪樣細胞[12]，是一種良好的組織工程學種子細胞。MSCs 目前具有重要的臨床應用價值及科研價值，在創(chuàng)傷修復、血管疾病等領域的應用價值已經得到很好的體現(xiàn)。EPCs 的應用也很廣泛且具有較高科研價值，在心肌梗死、血管生成、缺血性疾病等方面已有較多研究[13]，而且其在相關領域的應用價值也逐步擴大。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，EPCs 在MSCs 向脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞分化過程中，可以起到一定的促進作用。本課題組也研究發(fā)現(xiàn)，EPCs 是MSCs 的支持細胞之一，在促進MSCs 的自我更新(干細胞特性)方面有一定作用，對MSCs 干細胞特性的維持具有重要意義；MSCs 和EPCs 參與的生理過程相同，如血管生成，這與C.SEEBACH 等[14]的研究發(fā)現(xiàn)相似。因此，本研究探討EPCs 在MSCs 向肝細胞轉化中的作用，為今后臨床聯(lián)合干細胞移植提供一定的實驗理論依據(jù)。

表1 實驗組和模型對照組AFP 濃度數(shù)據(jù)分析(±s)

表1 實驗組和模型對照組AFP 濃度數(shù)據(jù)分析(±s)

注：*交互效應的F 統(tǒng)計量和P 值。

目前，很多學者[15]已證實大鼠MSCs 可在成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子、內皮生長因子、地塞米松、胰島素鐵硒傳遞蛋白等多種因子聯(lián)合誘導下，能在較短時間內分化為肝樣細胞。這是一種較滿意的誘導方法。EPCs 和MSCs 聯(lián)合培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)加入培養(yǎng)過EPCs 上清液的MSCs 經轉化培養(yǎng)，較單純用肝細胞轉化培養(yǎng)基培養(yǎng)的MSCs，在倒置顯微鏡下觀察可見細胞形成小梁樣結構，出現(xiàn)多角形和不規(guī)則形態(tài)，體積變大，胞漿變豐富，細胞內顆粒增加的時間及數(shù)量均明顯增多；在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞表達ALB 和AFP 的數(shù)量也增多、時間提前，這表明EPCs 促進了MSCs 向肝樣細胞的轉化，細胞具備了部分肝細胞的功能。

ALB、AFP 均為肝系細胞的特異性標志[16]。細胞AFP 免疫熒光檢測顯示，MSCs 在培養(yǎng)過EPCs 的上清液刺激下，細胞中出現(xiàn)AFP 的量均高于單純用肝細胞轉化培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。細胞ALB 免疫熒光檢測顯示，僅有加入培養(yǎng)過EPCs 上清液的實驗組，在第7 天細胞產生ALB，且第9 天ALB 濃度增高。這均提示，隨著誘導時間的延長，具有分泌AFP 的肝樣細胞逐漸增多，因ALB 是成熟肝細胞所分泌，也提示MSCs 具有轉化為成熟肝樣細胞的潛能。本實驗培養(yǎng)時間較短，培養(yǎng)觀察誘導細胞9 d，實驗組和模型對照組的AFP 均隨時間的延長出現(xiàn)升高趨勢，未見細胞成熟后AFP 產生減慢并逐漸降低的趨勢，對后期EPCs 對MSCs 的轉化影響尚未進行實驗和觀察；ALB 在實驗組也已產生，并可見濃度逐漸增高的趨勢，但因培養(yǎng)時間短，模型對照組細胞尚未見ALB的產生，可推斷EPCs 可能在一定程度上促進了肝樣細胞的成熟，但具體能起多大程度的促進作用，能使轉化細胞的成熟加速多少，尚待進一步的研究。

綜上所述，EPCs 在MSCs 向肝細胞轉化中起一定促進作用，而EPCs 在MSCs 向肝細胞誘導分化中是通過何種機制參與還有待于進一步探索；其次EPCs 對MSCs 在向肝細胞轉化的促進作用，也為細胞的聯(lián)合培養(yǎng)、聯(lián)合移植提供一種新的研究思路，為未來臨床上聯(lián)合干細胞加速細胞轉化提供一定的理論依據(jù)。