韓海霞，徐蕓蕓，劉 超，陸仁飛*

(江蘇省南通市第三人民醫(yī)院檢驗科，南通 226006)

傷寒沙門菌是腸桿菌科細菌研究的一種重要模式細菌[1]。傷寒沙門菌感染人類主要引起腸熱癥，經(jīng)血流擴散后最終會引起菌血癥等其他系統(tǒng)性疾病[2]。細菌在環(huán)境中通常不是以單個細菌樣式的浮游生長，而是大量細菌聚集在一起生長，以應對復雜的生存環(huán)境，細菌通過鞭毛、菌毛及自身分泌的多糖、纖維素、脂質蛋白等基質，相互黏附聚集形成高度組織化的膜樣聚合結構，即生物膜[3]?？v觀傷寒沙門菌污染食物、胞內生存，膽囊長期定植等幾個造成嚴重危害的關鍵節(jié)點，細菌都有以生物膜生長的形式，生物膜無疑成了最主要的“幫兇”。細菌在食物表面以生物膜的形式存在，可以克服低溫、干燥、消毒等不利因素[4]；細菌在單核巨噬細胞內形成生物膜以抵御低滲、強酸及氧化殺傷，最終隨著被感染的巨噬細胞進一步擴散[5]；細菌能在膽囊膽結石表面形成生物膜抵御膽汁、抗生素對其的損傷而長期存活[6]。另外，大量研究[7]表明生物膜內的細菌大部分是以“滯留菌”的形式存在，這是一種對目前任何抗生素都不敏感的“休眠期”細菌，因此細菌生物膜已經(jīng)成為處理傷寒沙門菌感染或其他細菌感染最關鍵和最棘手的問題。

早在1990年，就發(fā)現(xiàn)surA 基因是細菌穩(wěn)定期生長必不可少的[8]。6年后，SurA 被證明是一種位于細胞內外膜之間的一種類小蛋白樣肽基-脯氨酰異構酶，主要作用是運送和組裝外膜β-片層蛋白從胞漿通過周質到達外膜，與外膜組裝蛋白協(xié)同作用，生成外膜蛋白[9-12]。本課題組前期傷寒沙門菌生物膜環(huán)境細菌和指數(shù)生長期細菌的RNA-seq 數(shù)據(jù)顯示，2個轉錄組有279 個差異表達的基因，其中，差異表達上調前20 的基因中有5 個是外膜蛋白基因。因此，外膜蛋白在生物膜細菌中高表達，根據(jù)SurA 已報道的功能(對外膜蛋白在周質中的運送及正確折疊組裝至關重要)，推測周質伴侶蛋白SurA 可能與生物膜的形成有關系。為此，我們構建了surA 基因的缺陷株以及回補株，觀察了surA 基因缺陷株、野生株以及回補株的生物膜形成能力，再進一步對SurA 影響生物膜形成能力的機制進行探索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 傷寒沙門菌野生型(Wild Type,WT)GIFU10007 由日本岐阜大學惠贈。低拷貝阿拉伯糖可誘導載體pBAD 購自Invitrogen 公司。E.coli DH5α 由本實驗室保存。surA 基因缺陷株(△surA)、flhD 基因缺陷株(△flhD)、surA 基因缺陷空載體株(△surA-pBAD)、野生空載體株(WT-pBAD)、surA 基因缺陷回補株(△surA-psurA)由本實驗室制備和保存。

1.1.2 材料和試劑 胰蛋白胨、酵母浸膏和TSB 培養(yǎng)基購自OXOID 公司；NaCl、無水乙醇和異丙醇購自國藥集團；Trizol 購自Invitrogen 公司；L-阿拉伯糖、氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)和瓊脂糖購自Sigma 公司；聚苯乙烯96 孔板購自CORNING 公司；DNA 酶Ⅰ基因組消化試劑盒、逆轉錄試劑盒、SYBR實時熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊公司。

1.1.3 主要儀器 NanoDrop ND-1000 微量核酸定量儀(Thermo)；普通聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀(ABI 2720)；熒光定量PCR 儀、酶標儀(Bio-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)傷寒沙門菌野生株GIFU10007 基因組信息(本實驗室測序，未公布)，設計實時定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)定量引物，引物由蘇州泓迅生物公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 缺陷株及回補株的構建 Red 重組法制備surA 基因缺陷株，缺陷株以及回補株的構建同參考文獻[13-14]。

1.2.3 細菌培養(yǎng) 將傷寒沙門菌單菌落分別接種于2 mL LB 液體培養(yǎng)基(根據(jù)需要添加相應抗生素)，37 ℃、250 r/min 震蕩培養(yǎng)過夜。第2 天，1∶100 轉接到新鮮培養(yǎng)基(添加相應抗生素和適當濃度阿拉伯糖)，37 ℃、250 r/min 震蕩培養(yǎng)至所需的吸光度。

1.2.4 細菌生物膜實驗(結晶紫) 將過夜培養(yǎng)的細菌(WT-pBAD、△surA-pBAD、△surA-psurA)1∶100 轉接到20 mL TSB 培養(yǎng)基中(Amp 終濃度100 μg/mL，阿拉伯糖終濃度0.1%)繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.2，吸取200 μL菌液于無菌聚苯乙烯96 孔板內，孵箱30 ℃靜置培養(yǎng)約96 h，培養(yǎng)結束后，吸棄聚苯乙烯96 孔板內菌液，無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗孔內3 次后烘干，結晶紫溶液對生物膜染色15 min，加入250 μL 30%乙酸溶液溶解生物膜，酶標儀A570 波長測定每孔吸光度。

1.2.5 qRT-PCR 將過夜培養(yǎng)的細菌(WT 和△surA)1∶100 轉接到20 mL LB 培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至指數(shù)中期OD600=0.6，冰上放置10 min，4 000 r/min 離心10 min 收集細菌。Trizol 法提取細菌總RNA，經(jīng)DNA酶Ⅰ消化基因組DNA 后，隨機引物進行逆轉錄反應，同時設置不加逆轉錄酶參照孔。以cDNA 為模板，用上下游引物進行qRT-PCR，方法參照說明書，實驗每次3 個復孔，批間重復3 次，5s rRNA 為內參基因，基因表達量采用2-△△ct法計算。每次實驗均設對照組和實驗組。

1.2.6 電鏡觀察細菌鞭毛 將過夜培養(yǎng)的細菌(WT、△surA 和△flhD)繼續(xù)培養(yǎng)至穩(wěn)態(tài)早期OD600=1.2，菌液冰上放置，送揚州大學農學院生物樣本分析中心透射電鏡室做電鏡拍攝。

2 結 果

2.1 傷寒沙門菌surA 基因缺陷下調細菌生物膜形成能力 傷寒沙門菌生物膜結晶紫實驗顯示，與野生株(WT-pBAD)相比，缺陷株(△surA-pBAD)生物膜形成能力為野生株(WT-pBAD)的50%，而在缺陷株里回補了surA 基因后，回補株(△surA-psurA)的生物膜形成能力又恢復到野生株水平，說明傷寒沙門菌surA 基因缺陷具有下調細菌生物膜形成的能力(圖1)。

2.2 傷寒沙門菌surA 基因缺陷下調鞭毛相關基因表達 為了探索周質伴侶蛋白SurA 影響生物膜形成的機制，我們通過qRT-PCR 檢測影響傷寒沙門菌生物膜形成的幾個胞外基質及關鍵調控子在野生株(WT)和缺陷株(△surA)中的表達水平。實驗結果顯示，與WT 株相比，△surA 菌株中鞭毛相關基因(flhD、fliA、fljB)的mRNA 水平顯著下調，其中flhD 和fliB 的mRNA 水平下降為野生株的25%，fljA mRNA水平下降到野生株的10%(圖2)。說明surA 基因缺陷后下調傷寒沙門菌鞭毛表達。

表2 生物膜形成相關基質成分與基因

2.3 電鏡觀察surA 基因缺陷對細菌鞭毛表達的影響 為觀察surA 基因缺陷對細菌鞭毛表達的影響，對WT、△surA 及△flhD 菌株進行電鏡觀察。WT 菌株的鞭毛數(shù)約5～8 根(圖3A～C)；而△surA 菌株的鞭毛數(shù)僅2～3 根，由于動力減弱，通常2～3 個細菌聚集生長(圖3D～F)；由于缺失了鞭毛一級調控子FlhD，△flhD 菌株周身無鞭毛，細菌成簇生長(圖3G～I)。說明缺失surA 基因后，傷寒沙門菌鞭毛表達的數(shù)量明顯減少。

2.4 傷寒沙門菌鞭毛是細菌形成生物膜必不可少的基質 為觀察傷寒沙門菌鞭毛和細菌生物膜形成能力的關系，利用鞭毛一級調控子FlhD 的缺陷株進行生物膜實驗。如圖4 所示，鞭毛缺失菌株(△flhD)的生物膜形成能力顯著低于WT 菌株；甚至低于△surA 菌株的生物膜形成能力?？紤]到我們已經(jīng)證明傷寒沙門菌surA 基因缺陷下調鞭毛相關基因表達，因此傷寒沙門菌surA 基因缺陷可能通過下調鞭毛基因表達來影響生物膜形成。

3 討 論

細菌生物膜形成大致可分為3 個階段：(1)早期黏附階段，細菌游動聚集到有機或無機物表面，依賴鞭毛和菌毛相互黏附或黏附在固著物表面[15]；(2)中期細菌聚集群落形成，細菌開始分泌Curli 菌毛、纖維素、克拉酸、Bap 蛋白和胞外核酸等胞外基質，這些胞外基質堆積在細菌鞭毛和菌毛構建的“腳手架”樣細菌群落上[16-18]；(3)晚期為生物膜成熟期，更多的細菌和胞外基質黏附在一起，生物膜厚度和體積越來越大，內部營養(yǎng)和氧氣也越來越匱乏，細菌處于“休眠”狀態(tài)，這些細菌為了節(jié)約能量，幾乎不表達鞭毛等器官。處于生物膜表面的少量細菌受外部營養(yǎng)物或氧氣的“引誘”，開始脫離生物膜，重新成為浮游生長的細菌[19]。生物膜形成早期依賴鞭毛的表達；生物膜中晚期細菌鞭毛低表達。鞭毛高表達促進早期生物膜形成，鞭毛高表達后運動能力增強又增加了生物膜的消散，那么總體上鞭毛對于細菌生物膜形成是“利”還是“弊”呢？我們發(fā)現(xiàn)傷寒沙門菌缺失鞭毛一級調控子基因flhD 后，細菌幾乎全部喪失形成生物膜的能力，因此推測鞭毛對于生物膜形成是必不可少的基質。

SurA 主要作用是運送和組裝外膜β-片層蛋白從胞漿通過周質到達外膜，與外膜組裝蛋白協(xié)同作用，形成外膜蛋白，因此surA 基因缺陷后可能會導致外膜損傷。E.coli 中，周質中錯誤折疊的外膜蛋白堆積，導致誘導RpoE 介導的壓力反應，而RpoE 介導的壓力反應上調細菌的鞭毛表達[20]，這與本研究結果surA 基因缺陷后上調鞭毛表達結果相反，因此surA 基因缺陷上調鞭毛表達必然不是通過RpoE 介導的通路。外膜損傷可激活雙組份系統(tǒng)Rcs 活化[21]，活化的Rcs 系統(tǒng)負調控鞭毛表達[22]，那么surA 基因缺陷后，是否能激活Rcs 系統(tǒng)活化？這種假設需進一步證明。

周質伴侶蛋白SurA 功能具有多效性，其對于外膜蛋白的正確折疊及組裝是必不可少的，且可影響自轉運黏附素Ag43 和菌毛的生成，SurA 還影響大腸埃希菌屬，沙門菌屬和志賀菌屬生物膜形成和致病性。此外，鑒于SurA 的高度保守性，SurA 可能在其他革蘭陰性細菌中扮演相似的角色。因此，未來SurA 有可能成為針對革蘭陰性病原體有價值的藥物靶標。