嚴(yán)麗軍，徐立新，何紅梅，居玲玲，張湘云，邵建國(guó)***

(南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院1 肝病科，2 消化內(nèi)科，3 腫瘤科，南通 226006)

肝纖維化是指肝臟內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的過度沉積，它不是一個(gè)獨(dú)立的疾病，是許多慢性肝病共同的病理過程，幾乎各種慢性肝病(化學(xué)毒性、感染性、遺傳代謝性、自身免疫性以及膽汁淤積性)均可導(dǎo)致肝纖維化[1-2]。早已證實(shí)肝纖維化及早期肝硬化都是能夠?qū)崿F(xiàn)逆轉(zhuǎn)的。ECM生成及降解過程中所出現(xiàn)的失衡是肝組織在發(fā)生纖維化過程中重要的可逆性病理變化[3]。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)已被證實(shí)是彌漫性ECM的重要來源之一，且激活HSC 轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞(myo fibroblast,MFB)是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[4-5]。HSC 活化過程中會(huì)產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子、趨化因子和分子，炎癥是HSC 活化過程的關(guān)鍵因素[6]。許多炎癥因子在HSC 的活化過程中起關(guān)鍵作用，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β 和IL-6 等。此外，核因子(nuclear factor,NF)-κB、活性氧、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和多種生長(zhǎng)因子均可促進(jìn)HSC 的活化，與MFB 積累在一起，最終導(dǎo)致肝纖維化多種信號(hào)通路的核心病理生理改變[7]。

四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)是最有效的肝毒性化合物之一，使用CCl4構(gòu)建的動(dòng)物肝損傷模型是肝損傷的經(jīng)典模型[8]。CCl4經(jīng)依賴于細(xì)胞色素P450 的氧化酶激活后，分解為CCl3-和Cl-，而這些自由基會(huì)導(dǎo)致活性氧及脂質(zhì)過氧化物的過量產(chǎn)生，進(jìn)而對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生損傷，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用CCl4復(fù)制肝損傷小鼠模型。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(nucleotidebinding oligomerization domain,jeucine rich repeat and pyrin domain containing,NLRP3)炎性小體是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白復(fù)合物，是宿主免疫防御系統(tǒng)的重要成員，主要參與體內(nèi)炎性反應(yīng)，其主要組成包括NLRP3、效應(yīng)蛋白胱天蛋白酶-1(Caspase-1)及凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)[10]。NLRP3 炎性小體在肝臟中主要位于肝細(xì)胞，Caspase-1 對(duì)于將IL-1β未成熟型轉(zhuǎn)化為活性型至關(guān)重要，NLRP3 對(duì)刺激的反應(yīng)需要NF-κB 信號(hào)通路的參與。

白樺脂酸(betulinic acid,BA)是一種羽扇豆烷型五環(huán)三萜皂苷，存在于多種天然植物的樹皮中，主要在樺木屬中。研究[11-14]已證實(shí)BA 具有抗腫瘤、抗炎、抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、抗人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。但關(guān)于BA 是否對(duì)肝損傷有益的研究仍很少。因此，本研究旨在評(píng)估BA 對(duì)肝損傷發(fā)生時(shí)肝纖維化的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥物 BA 和水飛薊素(silymarin,SL)(純度均為97%)均購(gòu)自天津萬象恒遠(yuǎn)科技有限公司，且均使用5%CMC-Na 進(jìn)行混懸備用，BA 高、低劑量濃度分別為4、2 mg/mL；CCl4(純度為99.5%)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技公司。

1.2 動(dòng)物來源 購(gòu)自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的60只C57BL/6 小鼠(雄性，8～12 周齡，20～22 g)，飼養(yǎng)條件為室溫(22±1)℃、空氣濕度40%～50%、晝夜交替時(shí)間12 h、普通喂養(yǎng)及自由飲水，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 試劑 IL-6、IL-1β 和TNF-α 酶聯(lián)免疫試劑盒采購(gòu)于Elabscience 公司(批號(hào)為Ex210804)；NLRP3、甘油醛-3-磷酸脫氧酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、ASC、Caspase-1、(p-)NFκB、IL-1β、(p-)IκBα 抗體均來源于Cell Signaling Technology。

1.4 儀器 曝光儀(型號(hào)：Tanon 5200，上海天能科技)；臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)SCILOGEX 公司)；DYC 電泳儀(北京六一儀器廠)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(型號(hào)：680 型，上海眾生聲明科學(xué))。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 分組與給藥 60 只C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組、CCl4組、CCl4+SL(100 mg/kg，陽性藥物)、CCl4+BA 低劑量組(20 mg/kg)、CCl4+BA 高劑量組(40 mg/kg)，皮下注射CCl4(橄欖油1∶1)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化，劑量為3 mL/kg，每周2 次，連續(xù)6 周?？瞻讓?duì)照組小鼠注射等量無CCl4的橄欖油。建立肝纖維化模型后，BA組小鼠灌胃BA 20、40 mg/kg，SL組小鼠予SL 100 mg/kg 溶于生理鹽水灌胃，連續(xù)6 周?？瞻讓?duì)照組和CCl4組小鼠接受等量生理鹽水。

1.5.2 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)含量測(cè)定 末次給藥24 h 后小鼠眼眶采血，于4 500 r/min 離心15 min 后取上清液凍存于-80 ℃?zhèn)溆?，依?jù)試劑盒說明書對(duì)CCl4所引發(fā)的肝臟損傷小鼠模型血清中ALT、AST 的水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.3 血清及肝臟組織中細(xì)胞因子測(cè)定 末次給藥24 h 后眼眶取血，離心15 min(4 500 r/min)后將其上層清液取出并儲(chǔ)于-80 ℃?zhèn)溆?，依?jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒說明書對(duì)5組小鼠血清中細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的水平進(jìn)行檢測(cè)。用RIPA 裂解液提取各組小鼠肝臟組織總蛋白，離心15 min(12 000 r/min)后將其上層清液取出并儲(chǔ)于-80 ℃條件中備用，依據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)5組小鼠肝臟組織中細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β 和TNF-α)的含量。

1.5.4 肝臟組織病理學(xué)觀察 將處死后的小鼠肝組織取出，4%甲醛固定，石蠟包埋制成厚4 mm 的薄片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色，置于顯微鏡下對(duì)肝組織的病變情況進(jìn)行觀察。

1.5.5 免疫組化法測(cè)定小鼠肝臟中NLRP3 和p-NF-κB-p65 的表達(dá)情況 用4%多聚甲醛固定肝組織，將其包埋在石蠟中并切片，將石蠟切片在二甲苯和無水乙醇中脫蠟，在檸檬酸鈉緩沖液中微波干燥，并用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌；內(nèi)源性過氧化物酶活性被3%H2O2阻斷20 min；將每個(gè)樣品用5%山羊血清封閉20 min，然后在4 ℃下用一抗NLRP3(1∶200)和p-NF-κBp65(1∶200)處理；第2 天，PBS 洗滌3 次后，用山羊抗兔IgG 二抗處理20 min，然后將辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素工作液孵育20 min，PBS 洗滌3 次，然后用3-3′二氨基聯(lián)苯胺染色，最后蘇木精染色，脫水并干燥后，將切片用中性膠固定并在顯微鏡下觀察。

1.5.6 NLRP3/NF-κB 相關(guān)蛋白含量測(cè)定 使用RIPA 裂解液提取小鼠肝組織總蛋白，離心15 min(12 000 r/min)后收集上清液，通過BCA 試劑盒定量分析各蛋白含量。通過SDS-聚丙烯酰胺電泳將各蛋白樣本移至PVDF 膜上，隨后將其放置在含量為5%脫脂牛奶中封閉2 h；完成封閉后，將膜置于相對(duì)應(yīng)的一抗當(dāng)中，在4 ℃環(huán)境中過夜孵育；次日進(jìn)行4 次TBST 清洗，單次清洗時(shí)間為8 min，隨后放置在二抗中，在室溫條件下?lián)u晃孵育2 h，將膜取出進(jìn)行4 次清洗(TBST 清洗)，單次清洗時(shí)間為8 min，最終在凝膠成像儀中曝光并進(jìn)行掃描，分析各條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 BA 對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響 與空白對(duì)照組比較，小鼠在被注射CCl4后，血清ALT、AST 含量顯著增加；與CCl4組相比，BA 高低劑量組小鼠血清ALT、AST 含量顯著降低，見圖1。

2.2 BA 對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠血清與肝臟中細(xì)胞因子的影響 與空白對(duì)照組比較，CCl4組小鼠血清與肝臟組織中細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β 和TNF-α)含量都出現(xiàn)了明顯的上升；相較于CCl4組，BA 高、低劑量組小鼠血清與肝臟組織中細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)含量明顯下降，見圖2～3。

2.3 BA 對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝臟組織病理改變的影響 空白對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)無異常，肝細(xì)胞正常；而CCl4組小鼠的肝組織切片顯示肝細(xì)胞壞死、脂肪變性，門靜脈系統(tǒng)炎癥反應(yīng)嚴(yán)重；BA 高低劑量組則改善了CCl4導(dǎo)致的肝損傷小鼠的病理改變，見圖4。

2.4 BA 對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝臟組織NLRP3/NF-κB 通路蛋白表達(dá)的影響 相較于空白對(duì)照組，CCl4組小鼠肝臟組織中NLRP3/NF-κB 通路相關(guān)蛋白(NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、p-NF-κB-p65及p-IκBα)含量明顯增加；相較于CCl4組，BA 高低劑量均能抑制小鼠肝組織中NLRP3/NF-κB 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，見圖5。

2.5 BA 對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝臟組織NLRP3 免疫組化的影響 相較于空白對(duì)照組，CCl4組小鼠肝臟組織中NLRP3 蛋白含量明顯增加；相較于CCl4組，BA 高、低劑量組小鼠肝組織中NLRP3 蛋白含量明顯減少，見圖6。

3 討 論

本文采用CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)BA 能顯著降低模型小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)的活力，能減少CCl4誘導(dǎo)的肝損傷細(xì)胞中IL-6、IL-1β、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子的含量，且Western Blot 結(jié)果提示BA 可能是通過抑制NLRP3/NF-κB 信號(hào)通路起保護(hù)作用的。

ALT 和AST 為常用的肝纖維化檢測(cè)指標(biāo)，二者均位于肝細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞膜受損或細(xì)胞變性壞死時(shí)可釋放入血，因此血清中ALT、AST 水平能很快反映出肝細(xì)胞的損傷情況。AST 分布于細(xì)胞漿和線粒體內(nèi)，ALT 主要分布于細(xì)胞漿中，ALT 是肝損傷早期敏感性最強(qiáng)的轉(zhuǎn)氨酶，因此在診斷肝損傷中具有重要作用，其高低往往與病情輕重相平行；當(dāng)出現(xiàn)肝損傷之后，AST 的變化幅度遠(yuǎn)超ALT 而成為反映肝臟損傷程度的主要指標(biāo)。在本研究中，小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶的檢測(cè)結(jié)果顯示，CCl4損傷肝細(xì)胞后AST 和ALT 的含量均增加，而BA 干預(yù)后則降低了AST 和ALT 的水平。

在造成肝損傷的各種原因之中，炎性反應(yīng)具有重要的地位，減輕炎性反應(yīng)可有效緩解肝損傷，因此在肝損傷的治療中，抗炎保護(hù)肝細(xì)胞至關(guān)重要[15]。當(dāng)肝細(xì)胞存在實(shí)質(zhì)性損傷時(shí)，因受到外界的刺激而釋放大量炎性因子，如IL-1β、IL-6 和TNF-α 等，并作用于HSC、Kuffer 等細(xì)胞表面，從而誘發(fā)正向反饋調(diào)節(jié)，最終造成炎性因子的增加并加速病情的發(fā)展。IL-1β、IL-6、TNF-α 等含量在發(fā)生肝損傷后會(huì)顯著增加，并隨著病情的發(fā)展而不斷升高，說明在急性肝損傷的全程中IL-1β、IL-6、TNF-α 均有參與。在本研究中，CCl4刺激后血清和肝組織中的IL-6、IL-1β和TNF-α 均大幅度提升，而BA 能對(duì)CCl4所導(dǎo)致的肝組織中炎性因子的釋放能有效地抑制。

NF-κB 是Rel 蛋白家族的一員，其發(fā)揮生物學(xué)活性的主要形式是由p65/p50組成的異二聚體。在靜息狀態(tài)下，NF-κB 可與IκBα 結(jié)合形成三聚體，在細(xì)胞質(zhì)中以無活性的方式存在，受到外界刺激時(shí)會(huì)對(duì)一系列蛋白激酶進(jìn)行激活，如NLRP3 炎性小體等，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性反應(yīng)。NLRP3 在激活炎癥因子IL-1β 和IL-18 之后，導(dǎo)致宿主發(fā)生炎癥反應(yīng)[16-17]。NF-κB/NLRP3 通路在肝損傷過程中的炎性調(diào)節(jié)作用已明確。本研究表明，BA 能有效抑制CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝臟組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、p-NF-κB-p65 及p-IκBα 的表達(dá)。

綜上所述，本研究提示BA 可有效緩解CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷，且這一作用可能依賴于NF-κB/NLRP3 信號(hào)通路，其深入機(jī)制有待進(jìn)一步研究。