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        海馬外泌體中miR-219a-1-3p 對神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的影響*

        2020-06-30 07:39:30秦建兵田美玲趙荷艷金國華
        南通大學學報(醫(yī)學版) 2020年3期
        關鍵詞:封三星形外泌體

        李 雯,成 翔,秦建兵,田美玲,何 輝,趙荷艷,金國華*

        (南通大學醫(yī)學院人體解剖學系,神經(jīng)生物學研究所,南通 226001)

        神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞,存在于發(fā)育中的大腦和成年哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中[1]。NSCs 通過產生神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞(中樞神經(jīng)系統(tǒng)的3 種主要細胞類型)來促進神經(jīng)發(fā)生。在成人腦損傷和神經(jīng)退行性疾病的治療中,通過促進NSCs 分化來代償疾病丟失的神經(jīng)元具有潛在的應用前景[2]。我們先前的研究[3]表明,切斷基底前腦隔區(qū)神經(jīng)元向海馬的投射纖維后,海馬齒狀回門區(qū)和顆粒下層自體NSCs 表現(xiàn)出強大的增殖能力和神經(jīng)元分化特征,這與顆粒下層原本處于靜息狀態(tài)的NSCs 被激活密切相關。外泌體是一類直徑在40~150 nm 之間的細胞外微囊泡,在過去的10 余年中受到了科學的關注[4]。最近,從哺乳動物細胞釋放的外泌體被報道為一種細胞間通信的新載體,因為它可將脂質、蛋白質、mRNA、非編碼RNA 甚至DNA 轉運到其他細胞,在各種干細胞微環(huán)境中發(fā)揮重要作用[5]。在此背景下,我們利用高通量測序技術檢測去膽堿能神經(jīng)支配后海馬外泌體內轉錄本的表達變化,發(fā)現(xiàn)切割組外泌體中miR-219a-1-3p 顯著下調。為了更好地研究miR-219a-1-3p 與海馬外泌體促進NSCs 向神經(jīng)元分化之間的關系,本研究應用實時定量聚合酶鏈式反應(real-time polymerase chain reaction,Realtime PCR)、Western Blot 和免疫熒光等方法,對海馬外泌體miR-219a-1-3p 的下調進行了驗證,并檢測了miR-219a-1-3p 在大鼠全身多組織、細胞的表達情況以及對NSCs 分化為神經(jīng)元的影響,為更好地研究NSCs 的分化提供新思路。

        1 材料和方法

        1.1 實驗動物 實驗所用胚齡15 d SD 大鼠和220~250 g 成年SD 大鼠由南通大學實驗動物中心提供[動物許可證編號:SYXK(蘇)2012-0031]。動物實驗由南通大學實驗動物倫理委員會批準,并按照實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南進行。實驗過程中盡可能減少實驗動物使用數(shù)量,減輕實驗動物痛苦。用復合麻醉劑Chlorpent(0.2 mL/100 g 體質量)麻醉大鼠后行穹隆海馬傘切割術,無菌條件下切開顱頂部皮膚,分離骨膜以充分暴露前囟,記錄前囟A(矢狀軸)、L(冠狀軸)和V(垂直軸)的坐標,參照Paxinos《大鼠腦立體定位圖譜》確定雙側穹窿海馬傘的切割范圍。先在顱骨上確定左側兩點,即(1)A1=A-1.4、L1=L+1和(2)A2=A-1.4、L2=L+4,再確定右側兩點,即(3)A3=A-1.4、L3=L-1 和(4)A4=A-1.4、L4=L-4;然后用顱骨鉆在每點位置各鉆一小孔,(1)、(2)和(3)、(4)兩點間用刀片分別劃開一條骨縫,將針刀插入腦內,深度為V=V+5.4,針刀來回切割3 次后退出,待無明顯出血后用骨蠟封閉骨縫。最后,縫合皮膚,肌注青霉素,放回籠內飼養(yǎng)。

        1.2 海馬微環(huán)境總外泌體提取 切割術后7 d,無菌條件下依次剝離大腦表面被膜和血管,分離并提取海馬組織,加入2 mL 0.125%的胰蛋白酶,輕輕吹打成勻液,將上清液轉移至50 mL 離心管中,加入0.1 mol/L(pH 7.4)磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)復懸至30 mL,4 ℃3 000 g 離心30 min以除去碎片,將上清液轉移至新的50 mL 離心管;用220 nm 濾器過濾上清至30 ku 超濾管中,將濃縮上清液轉移至EP 管中,加入等體積的Total Exosome Isolation 試劑,渦旋混勻,4 ℃過夜;將樣品以4 ℃10 000 g 離心1 h,棄上清,加入適當體積PBS 將沉淀重懸。部分外泌體標本送上海烈冰生物醫(yī)藥科技有限公司進行RNA-seq 檢測。

        1.3 胚胎海馬NSCs 分離培養(yǎng)及體外誘導分化 胚齡15 d SD 大鼠,腹腔注射復合麻醉劑,無菌條件下取出胚胎,置于基礎培養(yǎng)液(無血清DMEM)中,分離出海馬,機械解離成單細胞懸液,離心后棄上清,用增殖培養(yǎng)液[DMEM/F12 1∶1,2% B27,20 ng/mL 堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),20 ng/mL 表皮細胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)]重懸,以密度(2~5)×105個細胞/T25 培養(yǎng)瓶種植。6~7 d 后將形成的神經(jīng)球消化傳代,種植于分化培養(yǎng)液[DMEM/F12 1∶1,2% B27,2%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)]中誘導分化,密度為5×104個細胞/mL,貼壁過夜后換液,將正常組和切割組海馬外泌體分別與NSCs 共培養(yǎng),或分別將miR-NC 和miR-219a-1-3p mimic 轉染至NSCs 中進行誘導分化。

        1.4 神經(jīng)元和星形膠質細胞的分離培養(yǎng) 胚齡15 d SD 大鼠,腹腔注射復合麻醉劑,無菌條件下取出胚胎,置于基礎培養(yǎng)液中,分離出大腦皮質,機械解離成單細胞懸液,離心后棄上清,培養(yǎng)神經(jīng)元用神經(jīng)元培養(yǎng)液(neurobasal,2 mmol/L 賴氨酸,2%B27)重懸,以密度2.8×106個細胞/10 cm 培養(yǎng)皿種植,6~7 d 后收集細胞提取RNA;培養(yǎng)星形膠質細胞用星形膠質細胞培養(yǎng)液(DMEM/F12 1∶1,10%FBS)重懸,3~4 d 后傳代,傳至第4 代時收集細胞提取RNA。

        1.5 Real-time PCR 取3 只成年SD 大鼠,麻醉后取端腦、小腦、腦干、海馬、心臟、肝臟和肌肉組織,分別用研磨器在Trizol 中研磨提取RNA;培養(yǎng)的細胞則用Trizol 直接裂解,提取總RNA。按照HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)第一鏈cDNA合成試劑盒(Vazyme Biotech 公司)說明書將1 μg 總RNA 逆轉錄成cDNA。按照Fast Start Universal SYBR Green Master(Roche)說明書,在StepOnePlusTMrealtime PCR 儀(Applied Biosystems 公司)中進行Realtime PCR,數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計分析。實驗所用引物由Sangon Biotech 和RiboBio 公司設計。

        1.6 Western Blot 用蛋白提取試劑盒(Pierce 公司)提取細胞總蛋白,測定濃度后進行凝膠電泳,Bio-Rad 半干轉印系統(tǒng)轉膜,5%脫脂奶粉將膜室溫封閉2 h,一抗4 ℃孵育過夜。次日二抗室溫孵育2 h,通過增強化學發(fā)光試劑盒(Bio-Rad 公司)進行顯像。用Shine-tech Image System 掃描并量化每個條帶的光密度值。實驗所用一抗:鼠抗Tuj1 單克隆抗體(1∶1 000,Millipore 公司),鼠抗β-actin 單克隆抗體(1∶1 500,Abcam 公司);二抗:辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000,Pierce 公司)。

        1.7 細胞免疫熒光 細胞爬片經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定30 min,用含有0.3%Triton X-100 和0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的0.01 mol/L PBS(pH7.4)室溫封閉2 h,加入一抗4 ℃過夜。次日用二抗在室溫下避光孵育2 h。細胞核用Hoechst33342(1∶1 000,Pierce 公司)復染,PBS 清洗后甘油封片。實驗所用一抗為鼠抗Tuj1 單克隆抗體;二抗為Alexa Fluor 488 綴合的(綠色)山羊抗鼠IgG(1∶1 000,Abcam公司)。

        2 結 果

        2.1 大鼠海馬外泌體促進NSCs 向神經(jīng)元分化 為了探究海馬組織外泌體在NSCs 分化中所起的作用,本實驗分別用Real-time PCR、Western Blot 和細胞免疫熒光進行檢測。Real-time PCR 檢測關鍵的神經(jīng)元特異分子,結果顯示,共培養(yǎng)24 h 后切割組Map2、Neurod1、Stmn2 和Syn1 表達開始顯著上調(圖1A,見封三)。Western Blot 結果表明,切割組Tuj1 蛋白表達量明顯上調(圖1B,見封三)。細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)切割組Tuj1 陽性神經(jīng)元比例明顯上調(圖1C,見封三),據(jù)此認為切割組海馬組織外泌體可促進NSCs 向神經(jīng)元分化。

        2.2 大鼠海馬外泌體RNA-seq 及驗證 外泌體RNA 測序顯示有24 個差異表達的miRNA,其中9個上調,15 個下調(圖2A~B)。Real-time PCR 結果顯示,與正常海馬外泌體相比,切割組外泌體中miR-219a-1-3p 表達下調(圖2C)。

        2.3 miR-219a-1-3p 在大鼠多組織細胞中的表達Real-time PCR 檢測miR-219a-1-3p 在成年大鼠的端腦、小腦、腦干、海馬、心臟、肝臟和肌肉組織中的表達,結果顯示miR-219a-1-3p 在端腦和海馬中的表達顯著高于其他組織,且在端腦中表達最高(圖3A)。Real-time PCR 檢測miR-219a-1-3p 在NSCs、神經(jīng)元和星形膠質細胞中的表達,結果如圖3B 所示,miR-219a-1-3p 在星形膠質細胞中表達最低,在NSCs 中表達最高。

        2.4 miR-219a-1-3p 對NSCs 向神經(jīng)元分化的影響為了探究miR-219a-1-3p 在NSCs 分化中的作用,我們用mimic 進行轉染,Real-time PCR 檢測其過表達效率,結果顯示,過表達組miR-219a-1-3p 水平顯著上調(圖4A,見封三)。接著對Map2、Neurod1、Stmn2 和Syn1 進行分析,結果表明4 個關鍵的神經(jīng)元特異分子均顯著下調(圖4B,見封三)。如圖4C(見封三)所示,在miR-219a-1-3p 過表達組中,Tuj1 蛋白的表達水平顯著下調。免疫熒光分析顯示,過表達組的Tuj1 陽性細胞少于對照組(圖4D,見封三)??傊?,這些結果表明miR-219a-1-3p 過表達抑制了NSCs 分化為神經(jīng)元。

        3 討 論

        神經(jīng)可塑性即損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)自我修復的能力,強烈依賴于神經(jīng)發(fā)生[6-7],假如能夠找到有效的方法促進海馬內源性神經(jīng)元再生與分化,或通過外源性手段補充丟失的神經(jīng)元,就可促進神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復,從而有效預防和治療各種疾病所致的認知功能障礙。海馬齒狀回的顆粒下層在整個生命過程中都有神經(jīng)發(fā)生的潛力[8]。本課題組先前的研究[3]表明,切割穹窿海馬傘阻斷隔區(qū)神經(jīng)纖維向海馬齒狀回的投射后,海馬結構內局部微環(huán)境的改變在一定時間內為NSCs 的存活、增殖和向神經(jīng)元分化提供了有利條件。

        外泌體是細胞外囊泡的亞型,具有獨特的結構特征和生物學功能。鑒于外泌體在細胞間通訊中可作為介質傳遞重要蛋白[9]、小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)[10]和微小RNA(microRNA,miRNA)[11-14],調節(jié)淀粉樣蛋白前體(amyloid precursor proteins,APP)和tau 蛋白的表達和功能,提示外泌體具有在臨床前階段用作診斷的生物標志物的潛力以及它們用于調節(jié)神經(jīng)變性的可能性[15]。自從2007年首次報道外泌體以來,外泌體來源的RNA 研究迅速增加。研究[16]表明,外泌體及其供體細胞的RNA 譜存在顯著差異。如致癌的miR-21 表達通過外泌體被上調和分泌,從而促進了許多惡性腫瘤的進展和轉移[17]。

        本研究將海馬的外泌體與NSCs 共培養(yǎng),觀察它們對NSCs 分化的影響。結果表明,NSCs 與切割組去神經(jīng)支配的海馬外泌體一起孵育,可促進更多的NSCs 分化為神經(jīng)元。利用高通量測序技術觀察去神經(jīng)支配后海馬外泌體內轉錄本的表達變化,結果顯示共有24 個miRNA 表現(xiàn)為轉錄激活狀態(tài)。鑒于在發(fā)育過程中miRNA 的表達受到調控,表現(xiàn)為在某一組織和細胞類型中富集,因此我們選取了發(fā)育自3個胚層的7 種組織及NSCs、神經(jīng)元和星形膠質細胞檢測差異miRNA 的表達水平。盡管在神經(jīng)系統(tǒng)中表達水平低的miRNA 也可能具有功能,但我們認為高表達的miRNA 更有可能在神經(jīng)生物學過程中起著至關重要的作用,因此主要關注miR-219a-1-3p。接著在海馬NSCs 中過表達miR-219a-1-3p,結果顯示過表達miR-219a-1-3p 抑制了NSCs 向神經(jīng)元的分化,該結果和切割組外泌體(較正常組外泌體中的miR-219a-1-3p 明顯下調)與NSCs 共培養(yǎng)獲得的促進NSCs 向神經(jīng)元分化的結果一致。

        圍繞本研究尚需要進一步探討的問題還有miR-219a-1-3p 靶向于調控NSCs 分化的mRNAs有哪些?相關的信號傳導途徑是什么?miR-219a-3p對NSCs 分化為特定表型神經(jīng)元(如膽堿能神經(jīng)元)有什么影響?外泌體中還有哪些非編碼RNA 與NSCs向神經(jīng)元的分化有關等。闡述這些問題將為揭示NSCs 分化機制和將外泌體應用于神經(jīng)退行性疾病的治療提供線索和新思路。

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