朱曉振，孟現(xiàn)堯，賈晨晨，于殿江，張美超，衣悅濤

（1.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東煙臺 264003；2.中國科學院大學，北京 100049；3.煙臺大學海洋學院，山東煙臺 264005）

仿刺參（Apostichopus japonicas）屬于棘皮動物門（Echinodermata），海參綱（Holothurooidea），是我國北方水產養(yǎng)殖中的重要經濟物種之一 （李成林等，2010）。仿刺參具有豐富的營養(yǎng)組成，同時也具有很高的藥用價值和經濟價值，自古以來就享有“海八珍”的美稱。但近年來受氣候變化影響，夏季持續(xù)高溫和降雨，對刺參池塘養(yǎng)殖造成嚴重影響。高溫導致水體溶解氧降低，影響仿刺參生理行為及代謝，同時會導致厭氧細菌大量繁殖并對有機物進行厭氧分解，產生大量氨氮、硫化氫、亞硝酸鹽等有害物質，損傷仿刺參的非特異性免疫系統(tǒng)，增加對病原菌的易感性（霍達等，2017；徐松濤等，2017）。另外，持續(xù)性的高溫會導致刺參出現(xiàn)消化道萎縮，消化功能減弱，體重減輕的現(xiàn)象。當環(huán)境溫度發(fā)生變化時，仿刺參腸道中的消化酶活性也會發(fā)生相應的改變，在適宜的溫度范圍內，適當的溫度升高會提高仿刺參腸道內消化酶的活力，對消化能力起到促進的作用，但一旦突破了臨界溫度，消化酶活性就會受到抑制甚至失活，進而對仿刺參的消化能力與生長產生影響，嚴重時會出現(xiàn)大面積死亡（楊秀生等，2009）。

益生元是一種不可被消化的食物組成部分，一些功能性低聚糖類、多糖類、天然植物提取物、蛋白質水解物、多元醇等均屬于益生元。益生元的結構特點為： 能選擇性地刺激腸道中有益菌群的生長繁殖和激活其代謝功能；使腸道菌群向有利于寄主健康的方向轉化；刺激免疫，提高機體免疫力；改善腸道內環(huán)境，還富有多種營養(yǎng)物質，促進生長。益生元作為一種新型綠色功能性飼料添加劑逐漸成為了動物營養(yǎng)與研究的新方向，已有各種各樣的益生元作為飼料添加劑應用于畜禽、水產的養(yǎng)殖生產中（鄧紫艷等，2015）。菊芋全粉作為一種富含益生元的植物多糖，其主要成分菊粉是一種水溶性果聚糖益生元，可調節(jié)動物機體腸道微生物組成、改善腸胃功能、增強免疫功能，被廣泛應用于食品和動物飼料中（陳佳億等，2018）。本試驗旨在探究菊芋全粉作為仿刺參飼料添加劑對高溫脅迫下仿刺參的消化能力及免疫力的影響，為生產實踐提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 試驗用仿刺參選用山東東方海洋科技股份有限公司育苗車間1 齡以上的刺參。挑選質量與活力較好的仿刺參，分別暫養(yǎng)于8 個容量為40 L 的養(yǎng)殖水箱中，每個水箱中隨機投放50 頭仿刺參。每日下午15 點定時投喂飼料，飽食投喂，投喂量一般為仿刺參體重的3%，投喂前及時清理殘餌及糞便，換水量為養(yǎng)殖水箱總水體的1/3。暫養(yǎng)1 周后用于試驗。

1.2 試驗分組 暫養(yǎng)結束后，選擇體格健壯、質量較好的仿刺參320 頭，隨機分為8 組，飼喂基礎飼料一個月；一個月后設置4 個溫度梯度，分別為18、23、28、32 ℃，每個溫度下設置 2 組，其中基礎組投喂基礎飼料，試驗組投喂添加15‰菊芋全粉的試驗飼料（分組情況見表1），暫養(yǎng)7 d，能正常攝食后進行分組試驗，試驗開始時稱重一次并記錄。

表1 仿刺參分組情況

1.3 高溫脅迫試驗 基礎溫度為18 ℃，升溫幅度為1 ℃（24 h），達到試驗溫度后進行恒溫飼養(yǎng)，當所有試驗組都到達預定溫度后，再按照其當前溫度恒溫飼養(yǎng)兩周，在高溫脅迫下將基礎飼料和添加菊芋全粉的飼料喂養(yǎng)的仿刺參進行對比研究，觀察仿刺參生長狀態(tài)，記錄成活率，高溫脅迫結束后，取仿刺參體腔液和腸道樣品，測定仿刺參體腔液中的各種免疫酶活性和消化酶活性。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 成活率測定 分別對不同試驗組仿刺參每日的死亡情況進行記錄，飼養(yǎng)階段結束后，計算不同試驗組仿刺參的存活率（SR）。

SR/%=Ni/No×100%。

式中：Ni 是飼養(yǎng)結束后仿刺參數量，No 是飼養(yǎng)開始時仿刺參數量。

1.4.2 免疫因子活力測定 在兩周高溫脅迫試驗結束后，分別從每組取出9 只健康仿刺參在冰盤上取體腔液樣品，于 4 ℃、3000×g 離心 10 min，取上清液保存在-80 ℃冰箱中備用，用作體腔液免疫指標的測定。體腔液樣品中過氧化氫酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LSZ）、一氧化氮合酶（NOS）活性均采用試劑盒（南京建成生物科技有限公司）測定。

1.4.3 消化酶活力的測定 在兩周高溫脅迫試驗結束后，分別從每組取出9 只健康仿刺參在冰盤上取腸道樣品，并且除去仿刺參腸道上黏附的呼吸樹及其他不相干成分，用無菌濾紙去除多余水分，置于凍存管內，-80 ℃下保存，用于消化酶的測定。測定前，將冷凍的腸道樣品取出解凍，準確稱取待測腸道重量，加入9 倍體積生理鹽水，在4 ℃的冰水浴條件下進行勻漿。勻漿結束后將樣品2500×g 離心10 min，然后取上清液放入凍存管待用。蛋白酶測定采用福林-酚法，淀粉酶測定采用碘-淀粉比色法，脂肪酶測定采用滴定法（樊英等，2017）。仿刺參腸道樣品蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性采用試劑盒（南京建成生物科技有限公司）測定。

1.5 數據處理與分析 數據用SPSS 16.0 軟件進行單素方差分析 （One-way AN0VA），結果以“平均值±標準差”表示，當P ＜0.05 時為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 菊芋全粉對高溫脅迫仿刺參成活率的影響由圖1 可知，在18 ℃及23 ℃的生長環(huán)境下，菊芋全粉組相較于普通飼料組，在存活率方面表現(xiàn)的更優(yōu)。當溫度達到28 ℃，菊芋全粉組仿刺參成活率 （88.75±1.25）%明顯高于普通飼料組 （85.25±2.75%，P ＜ 0.05）。這說明通過添加 15 g/kg 菊芋全粉能在一定程度上改善高溫脅迫下仿刺參的成活率。32 ℃時，菊芋全粉組成活率顯著下降，機理需要進一步研究。

圖1 菊芋全粉對高溫脅迫下仿刺參成活率的影響

2.2 菊芋全粉對高溫脅迫下仿刺參免疫因子變化的影響

2.2.1 菊芋全粉對仿刺參體液中過氧化氫酶（CAT）活力的影響 由圖2 可知，在同一溫度下，普通飼料組和菊芋全粉組CAT 活力差異不顯著。隨著溫度升高，與18 ℃和23 ℃相比，在28 ℃和32 ℃刺激下，仿刺參 CAT 活力顯著升高（P ＜ 0.05），其中普通飼料組和菊芋全粉組沒有顯著性差異。

圖2 菊芋全粉對仿刺參體液中過氧化氫酶（CAT）活力的影響

2.2.2 菊芋全粉對仿刺參體液中酸性磷酸酶（ACP）活力的影響 由圖3 可知，在 18 ℃和 28 ℃溫度下，相較于普通飼料組 （2.74±0.26、0.18±0.19 U/100 mL），菊芋全粉組 （3.11±0.53、2.59±0.29 U/100 mL）的仿刺參ACP 活力明顯提高 （P ＜0.05），23 ℃和32 ℃干預下，普通飼料組和菊芋全粉組仿刺參的ACP 活力沒有顯著性差異。

2.2.3 菊芋全粉對仿刺參體液中堿性磷酸酶（AKP）活力的影響 由圖4 可知，在同一溫度下，菊芋全粉組和普通飼料組無顯著差異；28 ℃菊芋全粉組（8.86±0.20 U/100 mL）與 18 ℃和 23 ℃菊芋全粉組（7.82±0.24、8.39±0.47 U/100 mL）相比具有顯著性差異（P ＜0.05）。普通飼料組和菊芋全粉組的AKP 活力均呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢，但是各個試驗組的差異并不顯著，其中28 ℃菊芋全粉組AKP 活力最高。

圖3 菊芋全粉對仿刺參體液中酸性磷酸酶（ACP）活力的影響

圖4 菊芋全粉對仿刺參體液中堿性磷酸酶（AKP）活力的影響

2.2.4 菊芋全粉對仿刺參體液中溶菌酶（LSZ）含量的影響 由圖5 可知，隨著脅迫溫度的升高，普通飼料組與菊芋全粉組的仿刺參體液中LSZ 含量都處于上升趨勢。而且28 ℃普通飼料組 （1.72±0.53 μg/mL）與菊芋全粉組（2.82±0.50 μg/mL） LSZ活力具有顯著性差異（P ＜ 0.05）。32 ℃干預下，與各組相比，菊芋全粉組LSZ 活力呈現(xiàn)最大值。

圖5 菊芋全粉對仿刺參體腔液中溶菌酶（LSZ）含量的影響

2.2.5 菊芋全粉對仿刺參體液中一氧化氮合酶（NOS） 活力的影響 由圖6 可知，在 18 ℃條件下，與普通飼料組相比，菊芋全粉組NOS 活力升高，說明在正常仿刺參養(yǎng)殖環(huán)境下，通過在飼料中添加菊芋全粉，可以改善NOS 活力。23 ℃普通飼料組NOS 活力顯著高于32 ℃普通飼料組；其次，在 18 ℃和 32 ℃條件下，菊芋全粉組（5.41±0.21、4.71±0.80 U/mL）NOS 活力明顯高于普通飼料組（4.90±0.79、3.79±0.67 U/mL）；而在 23 ℃條件下普通飼料組與菊芋全粉組差別很大。隨著溫度升高，普通飼料組NOS 活力呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，添加菊芋全粉組呈現(xiàn)先降低后升高趨勢。

圖6 菊芋全粉對仿刺參體腔液中一氧化氮合酶（NOS）活力的影響

2.3 菊芋全粉對高溫脅迫下仿刺參消化酶活力的影響

2.3.1 菊芋全粉對對高溫脅迫下仿刺參腸道蛋白酶活力的影響 由圖7 可知，隨著溫度的升高，普通飼料組和菊芋全粉組蛋白酶活力均升高，普通飼料組 （72.22±12.64 U/mL） 與菊 芋全 粉組（58.47±13.54 U/mL） 在 32 ℃時有顯著差異，并且蛋白酶活力明顯高于其他溫度組，其他溫度下添加菊芋全粉的飼料對蛋白酶活力沒有顯著影響。

圖7 菊芋全粉對高溫脅迫下仿刺參腸道蛋白酶活力的影響

2.3.2 菊芋全粉對高溫脅迫下仿刺參腸道脂肪酶活力的影響 由圖8 可知，隨著溫度升高，仿刺參腸道脂肪酶活力下降，在28 ℃時，菊芋全粉組（2.82±0.50 U/mL）脂肪酶活力顯著高于普通飼料組（1772±0.53 U/mL；P ＜ 0.05）。

圖8 菊芋全粉對高溫脅迫下仿刺參腸道脂肪酶活力的影響

2.3.3 菊芋全粉對高溫脅迫下仿刺參腸道淀粉酶活力的影響 由圖9 可知，在普通飼料組和菊芋全粉組中淀粉酶活力隨著溫度升高而降低，相比18 ℃，當溫度升高至32 ℃時，與菊芋全粉組（0.20±0.08 U/mL） 相比，普通飼料組 （0.10±0.02 U/mL） 淀粉酶活力下降更顯著 （P ＜ 0.05）。在 18 ℃與 32 ℃時，普通飼料組 （0.37±0.05、0.10±0.02 U/mL） 與菊芋全粉組 （0.31±0.05、0.20±0.08 U/mL） 的淀粉酶活力在組內存在顯著差異（P ＜ 0.05），其他試驗組變化不顯著。在高溫脅迫下，通過在飼料中添加菊芋全粉，有減緩高溫脅迫下淀粉酶活力降低的作用。

圖9 菊芋全粉對高溫脅迫下仿刺參腸道淀粉酶活力的影響

3 討論

3.1 菊芋全粉對仿刺參成活率的影響 益生元在水產養(yǎng)殖業(yè)中的作用越來越受到重視，研究表明益生元不僅可改善水產動物的生長性能（Guerreiro 等，2015），還可有效降低患病率和死亡率。本研究表明，在18、23 ℃和28 ℃溫度下，菊芋全粉組成活率明顯高于普通飼料組，說明在高溫脅迫下通過添加菊芋全粉可以降低仿刺參死亡率，添加菊芋全粉在一定高溫范圍內可以增強仿刺參在高溫脅迫下抵抗疾病和應激的能力，促使其成活率提高。有研究發(fā)現(xiàn)，在雜交羅非魚養(yǎng)殖過程中，在飼料中添加不同比例的甘露寡糖和低聚果糖可以提高動物成活率，增強非特異性免疫（何四旺等，2003）。溫度超過 32 ℃時，菊粉全粉組與普通飼料組成活率沒有差異，這時溫度已經超過刺參的耐受溫度值，導致仿刺參死亡。仿刺參隨體重的增加對高溫的耐受逐漸下降，小于25 g/頭的稚參在28 ℃仍可正常活動，而體重在160 g/頭左右的仿刺參在 22 ℃左右會進入夏眠狀態(tài)。此時仿刺參停止攝食，代謝水平較低，當水溫超過夏眠承受溫度時，仿刺參會出現(xiàn)吐腸、化皮等應激反應；當水溫升至 31 ℃以上時，會化皮死亡 （賀加貝等，2019）。

3.2 菊芋全粉對仿刺參免疫因子變化的影響溫度是影響仿刺參生長和發(fā)育的重要因素，夏季高溫，養(yǎng)殖水體中硫化物及氨氮含量超標，影響仿刺參存活，破壞仿刺參機體非特異性免疫防御系統(tǒng)，降低免疫力，導致對病原菌的易感性增加（徐松濤等，2017；臧元奇等，2012）。益生元作為功能性成分，目前已有較多研究表明其可改善水產動物腸道健康，增強機體免疫力，高溫脅迫環(huán)境中體內產生的大量活性氧會造成機體氧化損傷和免疫機能破壞，此時機體抗氧化防御酶系統(tǒng)（如 CAT等）啟動免疫應答。研究發(fā)現(xiàn)，在溫度由16 ℃上升至 26 ℃時，仿刺參機體的CAT 活力上升，持續(xù)26 ℃脅迫下又回落至較低水平（田相利等，2014；Ji 等，2008）。本研究中普通飼料組與菊芋全粉組CAT 活力都隨著溫度的升高而升高，在28 ℃高溫脅迫下，菊芋全粉組 （16.15±0.96 U/mL） CAT 活力高于普通飼料組 （15.81±0.53 U/mL），但沒有顯著性差異。ACP 和AKP 是兩種重要水解酶，可催化各種含磷化合物的水解過程。ACP 是巨噬細胞溶酶體的標志酶，其活性反映吞噬細胞清除異物的能力（劉云等，2008）。在 18 ℃和 28 ℃溫度下，菊芋全粉組 （3.11±0.53、2.59±0.29 U/100 mL） 的ACP 活力明顯提高。說明菊芋全粉在一定程度上可以緩解高溫脅迫下對仿刺參造成的機體免疫力下降。隨著脅迫溫度的升高和時間的延長，普通飼料組和菊芋全粉組的 ACP 活力呈現(xiàn)降低趨勢，研究結果顯示菊芋全粉可抑制ACP 活力降低的程度，這與刺參在干露和夏眠等脅迫條件下酶活力變化基本一致 （田相利等，2014；Du 等，2013）。AKP 是一種對底物專一性要求較低的磷酸單脂水解酶，可以起到解毒的功能，有改善機體免疫力的作用（Zhang 等，2000）。本研究中，AKP 活力在普通飼料組和菊芋全粉組均呈現(xiàn)先升后降低的趨勢，在脅迫溫度達到28 ℃時，菊芋全粉組 （8.86±0.20 U/100 mL） AKP 活力顯著高于普通飼料組（8.62±0.37 U/100 mL），同時當溫度高于 28 ℃時，菊芋全粉組可以減緩AKP 活力降低程度。說明在高溫脅迫下，通過在飼料中添加菊芋全粉可以使仿刺參保持較強的免疫防御能力。LSZ 是吞噬細胞殺菌的物質基礎，是非特異性免疫的重要組成部分，擔負著機體防御的功能。研究發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，LSZ 活力會升高，溫度超過 32 ℃，動物機體免疫系統(tǒng)受損，LSZ 活力也逐漸降低；同樣有研究發(fā)現(xiàn)在 32 ℃下處理 6～12 h 的仿刺參體腔液LSZ 活力顯著降低（Wang 等，2008）。在本研究中，隨著溫度升高，普通飼料組和菊芋全粉組LSZ 活力均升高，且在28℃高溫脅迫下，菊芋全粉組（2.82±0.50 μg/mL） LSZ 活力具有顯著性差異，說明在高溫刺激下，菊芋全粉可以增強刺參機體LSZ 活力，使得刺參在高溫脅迫能夠更有效地做出免疫調節(jié)反應，保護機體免受損傷。NOS 可以催化底物中L -精氨酸，在動物機體內產生NO，NO 可殺傷病毒、細菌，抑制感染，在免疫中起著重要的作用，NOS 活性影響NO 含量，從而體現(xiàn)免疫應激反應的情況（王廣軍等，2005）。隨著溫度升高，普通飼料組NOS 活力明顯下降，32 ℃時下降最明顯（3.79±0.67 U/mL）；相反，菊芋全粉的添加，降低了NOS 活力下降程度，在32 ℃高溫脅迫下，菊芋全粉組 （4.71±0.80 U/mL） NOS 活力顯著高于普通飼料組 （3.79±0.67 U/mL）。這說明，通過在飼料中添加菊芋全粉，使得仿刺參表現(xiàn)出對高溫脅迫的較強適應性。通過在飼料中添加菊芋全粉，在高溫脅迫下，能一定程度上增強刺參免疫因子活力，使得仿刺參在高溫脅迫下具有更好的耐受能力。

3.3 菊芋全粉對仿刺參消化酶活性的影響 消化酶是機體多種酶中的一部分，仿刺參腸道消化酶種類很多，主要是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。仿刺參為低溫性變溫物種，環(huán)境溫度是影響酶活性的重要因素，在夏眠過程中，仿刺參體內與代謝和免疫相關的酶活性會發(fā)生變化。消化酶（淀粉酶、脂肪酶）活性會下降，只有蛋白酶在此期間顯著升高（任慶印等，2013）。本研究中，隨著溫度升高，普通飼料組和菊芋全粉組蛋白酶活性均升高，淀粉酶活力和脂肪酶活力均下降。研究發(fā)現(xiàn)，仿刺參蛋白質含量豐富，需要依賴高活性蛋白酶攝取食物中的蛋白質，以合成自身蛋白，因此在刺參中蛋白酶活力最高（姜令緒等，2007）。在高溫脅迫下，32 ℃時普通飼料組 （72.22±12.64 U/mL） 蛋白酶活性顯著升高，通過在飼料中添加菊芋全粉（58.47±13.54 U/mL），為維持機體穩(wěn)定，高溫脅迫下降低了蛋白酶活性的升高趨勢。脂肪酶與淀粉酶同屬內源性消化酶，在刺參消化酶中活力最低（姜令緒等，2007）。隨著溫度升高，普通飼料組和菊芋全粉組脂肪酶活性都降低，菊芋全粉對脂肪酶活力沒有顯著影響。消化酶活性與仿刺參的營養(yǎng)吸收和生長關聯(lián)密切，消化酶活性的降低，影響著仿刺參的生長狀態(tài)與成活率。仿刺參腸道中淀粉酶也是主要的消化酶，在消化道不同部位的活性不同（袁成玉等，2007）。隨著脅迫溫度的升高，普通飼料組淀粉酶活性顯著降低，相反，菊芋全粉明顯降低了淀粉酶活性降低趨勢，說明在高溫脅迫下，添加菊芋全粉可維持仿刺參淀粉酶活性相對穩(wěn)定。研究表明，在飼料中添加益生元能夠增加腸道褶皺、腸上皮細胞以及微絨毛的高度，進而改變胃腸道的吸收區(qū)（Dimitroglou 等，2010）。在高溫脅迫下，通過補充菊芋全粉，淀粉酶活力降低趨勢得到改善，使得動物處于應激狀態(tài)時表現(xiàn)得更為突出。

4 結論

與普通飼料相比，高溫脅迫下，在飼料中添加菊芋全粉，在28 ℃以下，可以顯著提高仿刺參成活率；高溫脅迫下仿刺參免疫因子ACP 和AKP在菊芋全粉的影響下，可以維持相對穩(wěn)定，隨著脅迫溫度的升高，菊芋全粉組LSZ 活力顯著升高；高溫脅迫下，菊芋全粉對蛋白酶和脂肪酶的影響不大，但是可以顯著降低高溫刺激下淀粉酶活力降低趨勢。本試驗條件下，在飼料中添加15 g/kg菊芋全粉，在高溫脅迫下對于仿刺參成活率、免疫因子以及消化酶活性有一定改善作用。