胡蓆寶， 田晶晶， 梁若冰， 袁紅霞

Barrett食管(Barrett' s esophagus, BE )是指食管下段復層鱗狀上皮被化生的單層柱狀上皮替代的一種病理現(xiàn)象，可伴有或不伴有腸上皮化生，其中伴腸上皮化生者屬于食管腺癌(Esophagealadenocarcinoma，EAC)的癌前病變[1]。伴隨進食習慣改變，進食過量營養(yǎng)等生活習慣的變化，近年來EAC的發(fā)病率逐漸增長，尤其以西方國家顯著，其發(fā)病率己超過了食管鱗癌[2]，在EAC患者中，接近90%有BE既往史[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學對于BE的病因尚不完全明確，目前，尚未找到治愈BE的有效方法，現(xiàn)代醫(yī)學治療BE主要采用對癥治療和隨診，必要時可予內(nèi)鏡及手術治療，對于近期解決臨床癥狀療效可，但遠期療效尚未得到有力的實驗證實。因此，尋找有效合理的治療BE的方法，對有效防治BE及EAC的二級預防具有重要的臨床意義。近年來，中醫(yī)藥治療BE逐漸受到醫(yī)學界的重視，但目前對BE的病機認識尚未得到統(tǒng)一，藥物作用及其機理和途徑還未明確，限制了其臨床應用及推廣。本研究旨在通過檢測Ki-67和PCNA蛋白表達以探索加味啟膈散抑制細胞增殖對BE的治療機制，為BE的臨床治療及EAC的二級預防提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級成年健康Wistar 大鼠72只，10周齡，雌雄各半，體重（220±20）g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002。于動物實驗中心的標準化飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)，自由攝食進水。自然晝夜，自然光照。室內(nèi)通風，室溫維持在18～22 ℃，相對濕度維持于40%～70%。

1.1.2 實驗器材及試劑 烤箱（上海慧泰儀器制造有限公司DHG-9140A），中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司），山羊血清（北京元亨）抗體稀釋液（博士德 AR1016），鹽酸左氧氟沙星注射液（江蘇揚子江藥業(yè)），右旋糖酐鐵注射液（浙江天瑞藥業(yè)）， PCNA、Ki-67免疫組化試劑盒（MDL-北京百奧思科生物醫(yī)學技術有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及造模 全部動物以普通顆粒大鼠飼料常規(guī)適應性喂養(yǎng)1周，隨機將其分為6組，每組12只大鼠，分別為正常組，模型組，中藥全方組，中藥行氣活血組，中藥理氣化痰組，中藥化痰祛瘀組。除正常組外，其余五組均采用改良后的“食管十二指腸端側吻合加鐵劑術”制備BE模型[4]，具體方法為：取上腹正中劍突下約0.5 cm處，縱行切開皮膚約2 cm，然后沿腹白線剪開肌層和腹膜，將胃提出，剪斷肝胃韌帶，顯露食管，分離食管下段迷走神經(jīng)及血管，絲線結扎賁門，用無創(chuàng)動脈夾夾閉食管上段，固定食管，從賁門上0.3 cm處切斷食管；縫合賁門并荷包包埋入胃中，保留全胃；在距幽門1 cm處側壁避開血管縱行切開十二指腸壁約0.5 cm，隨后將食管下端全層與十二指腸切口行端側吻合，吻合完畢后進行分層縫合。術后24 h禁食不禁水，術后3日內(nèi)，每天每只大鼠腹腔注入鹽酸左氧氟沙星注射液1.5 mg/kg。術后第2周給予鐵劑，術后1天禁食不禁水，術后3天內(nèi)每天注入適量左氧氟沙星（1.5 mg/kg）到腹腔，同時給予葡萄糖鹽水自由飲用，術后14天注射右旋糖酐鐵液，每周2次，每次30 mg/kg，持續(xù)31周。

1.2.2 加味啟膈散及其拆方的制備 加味啟膈散全方組：沙參10 g，砂仁10 g，荷葉10 g，生姜6 g，郁金10 g，厚樸10 g，紫蘇10 g，茯苓10 g，川貝母10 g，清半夏10 g，丹參20 g，當歸20 g，仙鶴草30 g。行氣活血組（全方組去掉化痰藥）：全方組去茯苓10 g，川貝母10 g，清半夏10 g；理氣化痰組（全方組去掉祛瘀藥）：全方組去丹參20 g，當歸20 g，仙鶴草30 g；化痰祛瘀組（全方組去掉理氣藥）：全方去郁金10 g，厚樸10 g，紫蘇10 g。藥物選用北京康仁堂藥業(yè)有限公司中藥配方顆粒，將按照規(guī)定劑量的中藥配方顆粒以適量開水充分溶解，得到0.66 g/mL濃度中藥藥液，折合成生藥量為5.4 g/mL。按人與大鼠給藥劑量換算，大鼠每日給藥劑量為生藥10 g/kg。

1.2.3 給藥方法 31周造模成功，第32周開始，正常組及模型組大鼠，給予生理鹽水1 mL/100g灌胃，每日2次，各治療組大鼠分別給予相應藥液10 g/kg灌胃，每日2次，連續(xù)給藥14天后，處死并進行指標檢測。

1.2.4 處死及取材 各組動物進行處死前，均予禁食1天不禁水，然后采用10%水合氯(0.3 mL/100g) 腹腔注射麻醉,自吻合口以上約0.5 cm處剪取1.0 cm長食管組織，4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋并切片。

1.2.5 觀察指標及檢測方法

1.2.5.1 一般狀態(tài)觀察 每天觀察并記錄各組大鼠體重、毛色、精神狀態(tài)及進食情況。

1.2.5.2 細胞增殖相關指標測定 采用免疫組化法檢測PCNA、Ki-67 蛋白表達。結果判斷：Ki-67、PCNA 在細胞核中表達，以細胞核呈棕黃色至深棕黃色為 Ki-67、PCNA蛋白表達陽性。高倍視野（×400）下分別隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，觀察陽性細胞百分比。按陽性細胞所占比例分為：陽性細胞≤5%或細胞無棕色顆粒的視為陰性，記為“-”；陽性細胞占5 %～25%為弱陽性，記為“+”；陽性細胞占26 %～50%的為陽性，記為“++”；陽性細胞占＞ 50%為強陽性，記為“+++”。

1.3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)通過均數(shù)±標準差描述，計數(shù)數(shù)據(jù)通過頻數(shù)或率表示；多組間計量數(shù)據(jù)在滿足正態(tài)分布要求條件下進行方差分析；等級資料比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較時采用Bonferroni 對P值進行校正。以P＜0.05判定為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況觀察 各組大鼠體重隨周齡的變化而增加。于4周后，模型組、理氣化痰組、行氣活血組、化痰祛瘀組個別大鼠飲食量下降，活動度有一定降低；14周后觀察發(fā)現(xiàn)毛發(fā)無光澤、頸部脫毛、精神狀態(tài)差；全方組大鼠飲食量、活動度、毛發(fā)光澤度情況優(yōu)于模型組、理氣化痰組、行氣活血組及化痰祛瘀組，且無脫毛現(xiàn)象。正常組大鼠實驗過程中無死亡，模型組死亡3只，全方組死亡2只，行氣活血組死亡4只，理氣化痰組死亡5只，化痰祛瘀組死亡5只。對死亡大鼠進行解剖發(fā)現(xiàn)，4只死于吸入性肺炎、10死于彌漫性腹膜炎、5只死于吻合口狹窄。

2.2 各組大鼠Ki-67 蛋白表達 正常組中Ki-67蛋白的表達有1只為弱陽性；模型組中有8只為強陽性；理氣化痰組中有6只為強陽性；行氣活血組中有 5 只為強陽性；化痰祛瘀組中強陽性有4只。全方組中無強陽性，1只中等陽性，3只弱陽性，6只為陰性。組間方差分析結果顯示各組的Ki-67 表達水平差異有統(tǒng)計學意義（H=43.181，P＜0.001）。進一步Kruskal-Wallis H檢驗顯示，與正常組相比，全方組Ki-67表達水平無顯著差異（P＞0.05），而其他治療組與模型組的表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，全方組Ki-67表達顯著降低（P＜0.05）；與全方組比較，理氣化痰組和行氣活血組大鼠的 Ki-67 表達水平較高（P＜0.05），而中藥化痰祛瘀組與全方組間無顯著差異（P＞0.05）。見表1，圖1。

2.3 各組大鼠PCNA蛋白表達 正常組大鼠食管組織PCNA蛋白表達呈陰性；模型組中強陽性7只，中等陽性2只；理氣化痰組中強陽性5只，中等陽性和弱陽性各1只；行氣活血組中強陽性5只，中等陽性3只；化痰祛瘀組中強陽性3只，中等陽性4只；全方組中等陽性1只，弱陽性4只，陰性5只；正常組中均為陰性。組間方差分析結果顯示各組PCNA表達差異有統(tǒng)計學意義（H=41.587，P＜0.001）；進一步Kruskal-Wallis H檢驗顯示，與正常組比，模型組、理氣化痰組、行氣活血組和化痰祛瘀組PCNA表達水平均顯著升高（P＜0.05），全方組和正常組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比，全方組PCNA表達水平顯著降低（P＜0.05）；與全方組比，理氣化痰組和行氣活血組PCNA表達水平均顯著升高（P＜0.05），化痰祛瘀組與全方組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2，圖2。

表1 各組大鼠Ki-67 蛋白表達情況

圖1 各組大鼠Ki-67 蛋白表達（免疫組化法，×400）

表2 各組大鼠PCNA蛋白表達情況

圖2 各組大鼠PCNA 蛋白表達（免疫組化法，×400）

3 討論

BE是指食管黏膜上皮化生的一種病理變化。臨床上大多數(shù)BE患者常伴隨有燒心、反酸、胸骨后痛等胃反流的基本癥狀，故中醫(yī)將其列入到 “膈噎”的范疇。歷代醫(yī)家對其機制有不同的認識，《靈樞·上膈》：“氣為上膈者”?！豆沤襻t(yī)統(tǒng)》針對膈噎進行論述的過程中，則是認為“必有死血?！倍谒未岸鄶?shù)會基于寒和陰盛的角度來分析膈噎，《諸病源候論》之中記載的原因為：“陰陽不和，藏氣不理”。在金代與元代的時候，則更多的基于陰虛陽盛的角度形成一定程度的認知，諸如朱丹溪在著述中提出：“偏助陽氣，積成膈熱”等。由此可見膈噎病因病機復雜。

課題組根據(jù)多年臨床經(jīng)驗提出“痰、氣、瘀互結于食道”為BE的發(fā)病之本，食道為胃所主，故“胃失和降”為病機關鍵。憂思過慮、飲食不節(jié)、陰精損傷或久病等因素，首先傷及脾氣，脾傷則津液不布，聚而為痰，痰氣交阻于食道；肝為風木之臟，主疏泄而藏血，其氣升發(fā)，喜條達而惡抑郁，司情志；郁怒傷肝，肝失疏泄，氣為血之帥，氣郁則血停，瘀血阻滯于食道；痰、氣、瘀互結于食道，食道為胃所主，胃失和降日久出現(xiàn)了膈噎的癥狀，從而發(fā)生BE。

啟膈散出自《醫(yī)學心悟》，現(xiàn)代醫(yī)家根據(jù)“異病同治”理論，應用此方辨證論治反流性食管炎[5-6]、Barrett食管[7]、食管癌[8]等，均取得顯著療效。加味啟膈散則是在啟膈散的基礎上加味而成。全方組成為沙參、川貝母、茯苓、砂仁、郁金、丹參、當歸、半夏、厚樸、生姜、蘇葉、荷葉、仙鶴草，為理氣活血、化痰降逆之劑。其方證病機特點是痰氣瘀互結，胃失和降。沙參甘涼潤燥；川貝母苦辛瀉降，清熱化痰；合用滋潤干槁之胃脘，調(diào)理氣機阻滯，為君藥。茯苓甘淡和中；砂仁沁香悅脾，有助于開胃；郁金活血疏肝，解除煩郁，達到良好的破瘀以及清心等效果；丹參可以實現(xiàn)活血化瘀和營等基本的療效。當歸活血養(yǎng)血，助丹參活血之功；以上諸藥共奏利氣開郁、活血化痰之功，合為臣藥。方中半夏、厚樸、生姜、蘇葉等藥材取半夏厚樸湯之意，半夏化痰散結，降逆和胃；厚樸下氣除滿，助半夏散結降逆；生姜和胃止嘔，制半夏之毒；蘇葉芳香行氣，理肺舒肝，助厚樸行氣寬胸、宣通郁結之氣；通過辛苦合用的治療方式，辛以行氣散結，痰涎得化，專治證屬痰氣交阻的梅核氣，合為佐藥。荷葉為輕清之品，其性平，升舉清陽，可宣上焦陽氣，升提胃氣，于大隊降肅之藥中少佐可使升中有降，降中有升；仙鶴草收斂止血、消腫解毒，合為使藥。全方共奏行氣散結，化痰降逆，活血祛瘀，使郁氣得疏，痰涎得祛，瘀血得化。配伍嚴謹，標本兼治，諸藥配合合理，共成理氣活血、化痰降逆，從而使胃腑得降，癥狀得解。

正常的食管鱗狀上皮細胞大多數(shù)處于靜止狀態(tài)，僅部分基底層細胞有增殖能力。有研究[9]證明從正常食管到反流性食管炎到BE再到EAC，食管上皮的細胞增殖率依次逐漸增強。而目前反映細胞增殖常用檢測指標有 PCNA和Ki-67。PCNA和Ki-67是與細胞增殖密切相關的核蛋白，可反映細胞增殖活性和腫瘤惡性傾向。

Ki-67作為一個細胞增殖的標志物，在細胞增殖周期的細胞核中表達，在 G0 期和G1早期不表達，G1中期到晚期出現(xiàn)，S期和G2期逐漸增加，M期達高峰，M期后迅速降解或丟失抗原決定簇。Ki-67具有半衰期短、陽性表達覆蓋于整個有絲分裂期等優(yōu)點，被認為是判斷細胞增殖活性的重要參考指標[10-11]。有研究表明，Ki-67 表達高低與腫瘤的分化程度、轉移和預后緊密相關[12]。既往研究[13]顯示，在重度 RE和BE中Ki-67陽性率和表達強度相較于正常食管黏膜組織和一般的食管炎癥均明顯增高，提示 Ki-67的陽性表達在重度RE和BE的細胞增殖中有重要作用。因此，檢測Ki-67對判斷BE的發(fā)展及預后有一定的意義。

PCNA是DNA聚合酶的輔助因子，該蛋白主要聚集部位是細胞核，直接參與細胞增殖過程中DNA 復制，其在DNA合成的G1末期開始增加，在S期為最高峰，在G2期、M期含量明顯降低，與細胞周期中DNA合成狀態(tài)一致，是一種評價細胞增殖狀態(tài)的敏感指標。有研究[14]結果表明PCNA在食管鱗癌組織中的表達明顯高于癌旁組織及食管正常組織，并且食管鱗癌組織中細胞增殖越活躍，細胞增殖能力越高，食管鱗癌組織的分化程度越低，臨床分期越晚，其組織中的PCNA陽性表達率就會更高，說明在食管鱗癌的分化過程中PCNA是重要的參與者。還有很多研究發(fā)現(xiàn)在胃癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤組織等中PCNA陽性表達率也明顯高于癌旁組織以及正常組織[15-17]。由此可見對 PCNA 進行組織學檢測可以判斷細胞增殖活性及腫瘤惡性程度，從而有助于判斷疾病預后。

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比，全方組大鼠PCNA表達水平明顯降低，而全方組也不同程度地低于理氣化痰組、行氣活血組和化痰祛瘀組，說明加味啟膈散可有效抑制PCNA表達，且全方組的效果優(yōu)于各拆方組；正常組和全方組間大鼠的PCNA表達水平無明顯差異；理氣化痰組、行氣活血組和化痰祛瘀組間也無明顯差異。在 Ki-67 表達水平上，與模型組相比較，全方組大鼠的Ki-67 表達水平明顯低于模型組，說明加味啟膈散可有效抑制 Ki-67表達；而全方組也分別低于理氣化痰組和行氣活血組大鼠的Ki-67表達水平，與化痰祛瘀組大鼠的Ki-67 表達水平無明顯差異，與正常組和全方組間大鼠的Ki-67表達水平無明顯差異，說明全方組的效果優(yōu)于理氣化痰組和行氣活血組。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)加味啟膈散全方能顯著抑制大鼠BE模型的Ki-67及PCNA表達，作用分別優(yōu)于各拆方組，提示加味啟膈散可通過抑制BE時Ki-67、PCNA的過表達，從而抑制細胞過度增殖，起到對BE的治療作用。