劉晴坤,馮 華,任春曉,魏 薔,劉運(yùn)超,張改平,3

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450002；3.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450001)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,于1991年在加拿大首次鑒定分離出該病毒[1],PCV2為無囊膜的單鏈環(huán)狀DNA病毒,病毒全基因組大小在1 766～1 768 bp,可分為5種基因亞型PCV2a～e[2]。PCV2主要感染5～12周的斷奶仔豬,誘導(dǎo)機(jī)體的淋巴細(xì)胞凋亡和秏竭,導(dǎo)致免疫抑制[3],從而引起與其他病毒的混合感染[4],導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)消耗綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、豬繁殖障礙癥(Reproductive failure)等豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine circovirus association disease,PCVAD)的發(fā)生[5]。PCV2現(xiàn)已成為重要的病原體,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。

疫苗接種是預(yù)防豬圓環(huán)病毒感染的有效手段,目前市場上疫苗多以滅活苗和亞單位疫苗為主,但由于病毒培養(yǎng)滴度較低,這在一定程度上提高滅活苗的生產(chǎn)成本,現(xiàn)有原核表達(dá)的亞單位疫苗較少[6],因此,研制高效廉價(jià)的亞單位疫苗具有廣闊的應(yīng)用前景。PCV2的2個(gè)主要開放閱讀框(Open reading frame,ORF),ORF1編碼與病毒復(fù)制有關(guān)的蛋白酶(Rep,Rep′),其中ORF2編碼的衣殼蛋白(Cap)是PCV2的主要抗原[7],已廣泛應(yīng)用于疫苗設(shè)計(jì)。Beach等[8]把外源表位串聯(lián)在PCV2 Cap的C端,免疫動(dòng)物后,能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對Cap和該表位的體液免疫反應(yīng)；Huang等[9]的研究顯示,在Cap的C末端引入口蹄疫中和表位,同樣能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對Cap和所連接表位的免疫反應(yīng)。上述研究表明,Cap的C端是連接外源表位的較好位點(diǎn)。Shang等[10]鑒定出多個(gè)PCV2的優(yōu)勢表位,已應(yīng)用于PCV2表位疫苗的研究[11-12],其中表位195HVGLGTAF202位于loop GH和loop HI之間,該表位能刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的抗體水平,表位226LKDPPLNP233位于Cap的末端,是PCV2的中和表位,這2個(gè)表位在PCV2a和PCV2b中非常保守[13]。

目前,表達(dá)PCV2 Cap已有多種方法[14],其中,小分子泛素相關(guān)修飾物(Small ubiquitin-related modifier,SUMO)是一類廣泛存在于真核生物中且序列有高度保守性的小分子蛋白質(zhì),主要參與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)定位、細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性控制等胞內(nèi)活動(dòng),能促進(jìn)蛋白質(zhì)可溶表達(dá)和正確折疊,且已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的融合表達(dá)[15-17]。鑒于此,利用SUMO標(biāo)簽的這種特性,分別將確定的2個(gè)表位226LKDPPLNP233和195HVGLGTAF202以單獨(dú)和串聯(lián)的方式連接在Cap的C端并構(gòu)建至pE-SUMO載體；將構(gòu)建好的融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)后誘導(dǎo)表達(dá),純化目的蛋白,經(jīng)動(dòng)物免疫試驗(yàn),探究PCV2 Cap的C末端連接PCV2不同表位對Cap免疫原性的影響,為新型PCV2亞單位疫苗的研發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、抗體與質(zhì)粒

JM109感受態(tài)細(xì)胞和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自莊盟生物基因科技有限公司,pE-SUMO載體、已構(gòu)建好的在Cap的C端連接表位226LKDPPLNP233的重組表達(dá)載體pE-SUMO-Cap-e1、PCV2 Cap單克隆抗體3H6均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

Primer STAR Max DNA Polymerase購自大連寶生物工程有限公司；DL2000 DNA Marker 購自莊盟國際生物基因科技有限公司；彩虹180廣譜蛋白Marker、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒和SUMO蛋白酶均購自北京索萊寶科技有限公司；限制性內(nèi)切酶BsaⅠ、BamHⅠ和T4DNA連接酶均購自NEB公司；鼠源6×His標(biāo)簽抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗購自亞科因生物技術(shù)有限公司(Abbkine)；Ni-NTA填料購自Novagen公司；弗氏佐劑購自Sigma公司；PCV2滅活苗購自上海海利生物技術(shù)股份有限公司；PCV2抗體檢測試劑盒購自無錫優(yōu)聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 目的基因擴(kuò)增

根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性對PCV2b(GenBank: AY969004.1)cap基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化(http://www.jcat.de/),優(yōu)化后由上海生工合成。根據(jù)合成的cap序列設(shè)計(jì)上下游特異性引物(表1),下游引物PCV2b-R2表示連接表位195HVGLGTAF202,下游引物PCV2b-R12表示表位195HVGLGTAF202和226LKDPPLNP233的串聯(lián),引物由鄭州尚亞公司合成。以合成的cap全序列為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件為：94 ℃高溫完全變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸10 min。

1.4 重組表達(dá)載體構(gòu)建

將回收的2個(gè)目的基因和pE-SUMO質(zhì)粒分別用BsaⅠ和BamHⅠ在37 ℃雙酶切3 h,之后85 ℃失活20 min,回收后在T4連接酶作用下4 ℃過夜連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞,在37 ℃無抗性LB中培養(yǎng)1 h后均勻涂布到含有50 μg/mL氨芐青霉素抗性的平板上培養(yǎng)過夜,每個(gè)重組載體挑出5個(gè)陽性克隆,經(jīng)菌液PCR初步鑒定后再測序驗(yàn)證。

1.5 重組蛋白可溶性分析

將3種重組表達(dá)載體按上述操作轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,挑選對應(yīng)的陽性克隆,分別接種至5 mL含50 μg/mL氨芐青霉素的LB中,培養(yǎng)至菌體OD600約0.4～0.6,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,以不加任何誘導(dǎo)劑做陰性對照,降溫至26 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h,收集菌體,細(xì)胞超聲破碎后(工作4 s停8 s,破碎2 min)12 000 r/min離心分離上清和沉淀,SDS-PAGE鑒定可溶性表達(dá)情況。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列Tab.1 The primer sequence for PCR amplification

1.6 重組蛋白的純化與鑒定

分別取pE-SUMO-Cap-e1、e2、e12蛋白可溶性上清,采用Ni-NTA親和層析純化目的蛋白質(zhì),分別將3種重組蛋白的上清液、流穿液、洗滌液、洗脫液經(jīng)SDS-PAGE鑒定,再用鼠源6×His標(biāo)簽抗體做Western Blotting驗(yàn)證。

1.7 重組蛋白的酶切與鑒定

根據(jù)SUMO蛋白酶使用說明書推薦的緩沖條件和蛋白酶用量,分別將純化的蛋白于4 ℃酶切過夜,再次用Ni-NTA親和層析除標(biāo)簽,SDS-PAGE檢測3種蛋白是否切開,再用PCV2的Cap單抗3H6鑒定目的蛋白的免疫反應(yīng)性。

1.8 動(dòng)物免疫試驗(yàn)

20只6周齡SPF級雌性Balb/c小鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,隨機(jī)分成5組,每組4只,初次免疫時(shí),Cap-e1、e2、e12分別與弗氏完全佐劑等體積乳化,在接下來的加強(qiáng)免疫中與弗氏不完全佐劑等體積乳化,每次免疫劑量定在每只30 μg,經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射,每2周免疫1次,共免疫3次,同時(shí)設(shè)置PBS為陰性對照組,疫苗為陽性對照組,分別在第2周、第4周、第6周斷尾采血分離血清。

1.9 抗體效價(jià)測定

采用江蘇無錫優(yōu)聯(lián)PCV2抗體檢測試劑盒檢測血清抗體：分別將第2周、第4周、第6周所收集分離的血清稀釋到4 000倍,以100 μL/孔加入試劑盒抗原包被板中,在37 ℃反應(yīng)1 h,PBST清洗3遍,加入100 μL 1∶1 000稀釋的羊抗鼠二抗,37 ℃反應(yīng)1 h,PBST清洗3遍,加入100 μL底物TMB,避光反應(yīng)10 min后,加 50 μL 2 mol/L 硫酸終止反應(yīng),在酶標(biāo)儀上讀取OD450。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴(kuò)增

分別用2對引物(PCV-F 和PCV-R2、PCV-F 和PCV-R12)擴(kuò)增目的基因,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果如圖1,在約750 bp處有對應(yīng)的擴(kuò)增條帶出現(xiàn),與預(yù)期產(chǎn)物大小(747，777 bp)相符合,陰性對照未在目的大小處出現(xiàn)條帶。

M. DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DL2000；1.cap-e2的擴(kuò)增；2.陰性對照；3.cap-e12的擴(kuò)增；4.陰性對照。M.DL2000 DNA Marker;1.Amplification of cap-e2;2.Negative control;3.Amplification of cap-e12;4.Negative control.

2.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109后分別對挑出的5個(gè)單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定(圖2),再將菌液PCR為陽性的單克隆測序鑒定,結(jié)果顯示,融合基因成功構(gòu)建至pE-SUMO表達(dá)載體中。將連接表位195HVGL GTAF202的重組表達(dá)載體命名為pE-SUMO-cap-e2、連接2個(gè)表位的重組表達(dá)載體命名為pE-SUMO-cap-e12。將已有的重組載體pE-SUMO-cap-e1和新構(gòu)建的2個(gè)重組載體分別轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)。

A、B.pE-SUMO-cap-e2、e12的菌液PCR鑒定： M.DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DL2000；1-5.PCR產(chǎn)物；6.陰性對照。A,B.PCR identification of pE-SUMO-cap-e2,e12: M. DL2000 DNA Marker;1-5.PCR products;6.Negative control.

2.3 重組蛋白可溶性分析

SUMO在SDS-PAGE中分子質(zhì)量顯示為17 ku大小,Cap的分子質(zhì)量大小約28 ku,重組蛋白分子質(zhì)量大小在45 ku左右。3種重組表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE鑒定(圖3),對比發(fā)現(xiàn),在約48 ku大小處,IPTG誘導(dǎo)后的上清中(泳道2、5、8)均有較粗的條帶出現(xiàn),其大小和目的蛋白質(zhì)大小吻合,未誘導(dǎo)的全菌(泳道1、4、7)在48 ku大小處只有1條較細(xì)的條帶,沉淀(泳道3、6、9)中無明顯對應(yīng)條帶的出現(xiàn),初步證明這3種蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)(圖3)。

2.4 重組蛋白的純化與鑒定

細(xì)胞超聲破碎后離心取上清,對3種重組蛋白上清液分別進(jìn)行Ni-NTA親和層析純化,經(jīng)SDS-PAGE鑒定,在200 mmol/L咪唑洗脫條件下,均能在48 ku大小處得到較高純度蛋白質(zhì)(圖4-A-C),與預(yù)期蛋白大小吻合。經(jīng)Western Blotting鑒定(圖4-D-F),3種重組蛋白均與鼠源6×His標(biāo)簽單抗有特異反應(yīng)。初步證明,純化獲得的3種重組蛋白SUMO-Cap-e1、SUMO-Cap-e2、SUMO-Cap-e12均表達(dá)正確。

M. 蛋白質(zhì)Marker；1,4,7. pE-SUMO-cap-e1、e2、e12未誘導(dǎo)全菌；2,5,8. pE-SUMO-cap-e1、e2、e12誘導(dǎo)后上清；3,6,9. pE-SUMO-cap-e1、e2、e12誘導(dǎo)后沉淀。

M. Protein Marker;1,4,7. Total protein of pE-SUMO-cap-e，e2，e12 before induction;2,5,8. Supernatant of pE-SUMO-cap-e1，e2，e12 after induction;3,6,9. Sediment of pE-SUMO-cap-e1，e2，e12 after induction.

圖3 重組蛋白可溶性分析
Fig.3 Solubility analysis of recombinant proteins

純化SUMO-Cap-e1、e2、e12的SDS-PAGE(A-C)和Western Blotting鑒定(D-F)：M. 蛋白質(zhì)Marker； 1. SUMO-Cap-e1、e2、e12蛋白上清；2. SUMO-Cap-e1、e2、e12蛋白流穿液；3. SUMO-Cap-e1、e2、e12蛋白洗雜液；4. SUMO-Cap-e1、e2、e12蛋白洗液。SDS-PAGE(A-C)and Western Blotting identification of purified SUMO-Cap-e1，e2，e12: M. Protein Marker;1.Supernatant of SUMO-Cap-e1，e2，e12; 2. Flow through of SUMO-Cap-e1，e2，e12;3. Wash fraction of SUMO-Cap-e1，e2，e12;4. Elution fraction of SUMO-Cap-e1，e2，e12.

2.5 重組蛋白的酶切與鑒定

按照SUMO蛋白酶說明書推薦的緩沖條件,3種重組蛋白均在4 ℃酶切過夜,Ni-NTA親和層析純化除標(biāo)簽,經(jīng)SDS-PAGE(圖5-A)鑒定表明,在目的條帶大小處有對應(yīng)條帶出現(xiàn),證明3種重組蛋白均被成功切開,獲得Cap-e1、Cap-e2和Cap-e12目的蛋白。Western Blotting(圖5-B)結(jié)果表明,3種重組蛋白均與PCV2的Cap單抗3H6發(fā)生特異免疫反應(yīng)。

A、B.重組蛋白酶切：M.蛋白質(zhì)Marker； 1.SUMO-Cap-e1；2.Cap-e1；3.SUMO-Cap-e2；4.Cap-e2；5.SUMO-Cap-e12；6.Cap-e12。

A，B.Enzyme digestion of recombinant proteins:M.Protein Marker;1.SUMO-Cap-e1;2.Cap-e1;3.SUMO-Cap-e2;4.Cap-e2;5.SUMO-Cap-e12;6.Cap-e12.

圖5 重組蛋白的酶切與鑒定
Fig.5 Enzyme digestion and identification of recombinant proteins

2.6 抗體測定

用PCV2抗體檢測試劑盒檢測血清抗體,圖6結(jié)果表明,在整個(gè)試驗(yàn)過程中,除PBS組外,其他試驗(yàn)組和疫苗組一樣,均能刺激機(jī)體持續(xù)產(chǎn)生針對Cap的抗體,在第2周時(shí)(圖6-A),Cap-e2組幾乎沒有與Cap特異反應(yīng)的抗體,Cap-e1組和Cap-e12組產(chǎn)生的抗體水平很低,疫苗組產(chǎn)生的抗體略高于試驗(yàn)組。在第4周時(shí)(圖6-B),除PBS組外,其他組與Cap特異反應(yīng)的抗體均有大幅度提升,其中疫苗組顯著高于其他組,Cap-e12組顯著高于Cap-e1組和Cap-e2組,Cap-e2組也顯著高于Cap-e1組。在第6周時(shí)(圖6-C),抗體滴度持續(xù)上升,Cap-e12組同樣顯著高于Cap-e1組和Cap-e2組,Cap-e2組同樣顯著高于Cap-e1組,而疫苗組和Cap-e12無顯著差異。

A-C. 2，4，6周時(shí)PCV2 Cap的抗體水平。A-C. PCV2 Cap-specific antibody level at 2, 4 and 6 weeks.

3 結(jié)論與討論

PCV2主要引起斷奶仔豬PMWS的發(fā)生,導(dǎo)致患病豬進(jìn)行性消瘦、生長遲緩、呼吸困難和腹瀉等臨床癥狀,嚴(yán)重影響仔豬的生長發(fā)育[5],疫苗接種能有效預(yù)防PCV2的感染,現(xiàn)有上市PCV2疫苗以滅活和亞單位疫苗為主,滅活苗成本較高,而原核表達(dá)的亞單位疫苗較少[6],因此開發(fā)廉價(jià)高效的PCV2亞單位疫苗具有廣闊前景。將鑒定出的多個(gè)PCV2 Cap優(yōu)勢表位串聯(lián)表達(dá),制備試驗(yàn)多表位疫苗,免疫小鼠結(jié)果表明,這種試驗(yàn)表位疫苗能刺激小鼠產(chǎn)生針對PCV2 Cap的抗體[11-12]。然而,這種多個(gè)表位的串聯(lián)難以模擬連接的表位在Cap上的真實(shí)狀態(tài)。通過把不同外源表位連接在Cap的C端研究其免疫原性,該連接方式能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生針對Cap和所連接外源表位的抗體[8-9]。但目前對Cap的C末端連接PCV2自身表位對其免疫原性的影響還很少涉及,基于以上的考慮,利用SUMO融合標(biāo)簽?zāi)艽龠M(jìn)蛋白的可溶表達(dá)和正確折疊的特點(diǎn),通過pE-SUMO融合表達(dá)載體,在完整表達(dá)出PCV2 Cap蛋白的基礎(chǔ)上,把PCV2 Cap的不同表位連接在Cap的C端,研究連接的表位及連接的表位數(shù)量對Cap的免疫原性的影響。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了2個(gè)pE-SUMO重組表達(dá)載體,與之前本實(shí)驗(yàn)室保存的重組載體誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE和Western Blotting驗(yàn)證,3種重組蛋白可溶且正確表達(dá),純化得到較高純度的目的蛋白,去標(biāo)簽后分別與相應(yīng)的弗氏佐劑乳化并免疫Balb/c小鼠,抗體檢測發(fā)現(xiàn),除第2周外,免疫組Cap-e2 (195HVGLGTAF202)的抗體水平均高于Cap-e1組(226LKDPPLNP233)，說明表位195HVGLGTAF202比表位226LKDPPLNP233能更有效刺激體液免疫反應(yīng),Cap-12組的抗體水平均要高于只連接1個(gè)B細(xì)胞表位的試驗(yàn)組,雖然疫苗組在第2周和第4周的抗體水平均顯著高于Cap-12組,但在第6周時(shí)Cap-12組與疫苗組無顯著差異。在整個(gè)過程中,除PBS組外,各試驗(yàn)組和疫苗組均能持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。以上試驗(yàn)結(jié)果表明,正是抗原表位展示數(shù)量的差異造成蛋白免疫原性的不同,因此可以通過連接PCV2 Cap的多個(gè)優(yōu)勢表位,通過多個(gè)表位展示以達(dá)到產(chǎn)生與Cap特異反應(yīng)的高水平抗體。而當(dāng)前正在發(fā)生PCV2流行毒株的進(jìn)化和轉(zhuǎn)變[18-19],給PCV2疫苗研發(fā)提出了新的挑戰(zhàn),因此,以期通過此法制備更高效和交叉保護(hù)的亞單位疫苗,相關(guān)后續(xù)試驗(yàn)正在進(jìn)行中。本研究首次比較了PCV2 Cap的C端連接自身不同數(shù)量表位對Cap的免疫原性的影響,為新型PCV2亞單位疫苗研發(fā)提供了一定的參考。