陳露露,王 會,王吉坤,柴志欣,王嘉博,陳智華,信金偉,姬秋梅,鐘金城

(1.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省、教育部重點實驗室,西南民族大學(xué),四川 成都 610041；2.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室,西藏 拉薩 850009)

牦牛(Bosgrunniens)主要生活在青藏高原,具有“高原之舟”的美譽,較其他畜種,其繁殖和生產(chǎn)性能低下,但它能夠很好地適應(yīng)高原氣候,如稀薄的空氣、低溫、強烈的紫外線輻射等惡劣環(huán)境,被認為是研究哺乳動物高原適應(yīng)性的良好模型[1-2]。同時,它也能充分利用高原地區(qū)天然草地為人們提供優(yōu)質(zhì)健康的食品,如牦牛奶、牦牛肉[3]。類烏齊牦牛肉質(zhì)較其他牦牛品種肉質(zhì)更為鮮美,而肉質(zhì)的重要決定因素之一是肌內(nèi)脂肪[4-5]。在動物體內(nèi),脂肪形成、脂肪分解和脂肪酸轉(zhuǎn)運導(dǎo)致肌內(nèi)脂肪沉積,脂肪沉積量同時也受脂肪細胞和肌肉細胞比例的影響[6-7]。通常,成年牛肌肉內(nèi)脂肪貯藏庫的大小取決于甘油三酸酯的合成和降解之間的平衡,而肌內(nèi)脂肪的沉積速率不僅取決于肌內(nèi)脂肪細胞的數(shù)量和內(nèi)在活性,還取決于肌肉生長速率和其他器官的代謝活性[8-9]。

關(guān)于牛脂代謝分子機制的研究,學(xué)者發(fā)現(xiàn)雷帕霉素復(fù)合物1基因(TORC1)和雷帕霉素復(fù)合物2基因(TORC2)是牛肌內(nèi)脂肪形成的調(diào)節(jié)劑,且TORC2是脂肪形成的正調(diào)節(jié)劑[10-11]；線粒體Sirtuin 4基因(SIRT4)可以在營養(yǎng)豐富的條件下抑制脂肪酸氧化并促進脂質(zhì)合成代謝,該基因敲低可能會影響E2F轉(zhuǎn)錄因子1基因(E2F1)、干擾素調(diào)節(jié)因子4基因(IRF4)和增強子結(jié)合蛋白β基因(CEBPβ)等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)秦川牛脂肪細胞分化的能力[12]；飼糧能量水平升高能夠使牦牛皮下脂肪中參與脂肪分解的酶活性顯著降低[13]；使用具有高含量的濃縮物的飲食,可能會增加肌內(nèi)脂肪在牛肉的沉積[14-16]。Liu等[17]發(fā)現(xiàn)脂肪酸結(jié)合蛋白2基因(FABP2)、脂肪酸結(jié)合蛋白3基因(FABP3)、多配體受體簇36基因(CD36)和脂蛋白脂肪酶基因(LPL)參與脂肪酸轉(zhuǎn)運；肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1B基因(CPT1B)、細胞色素P450 4A22基因(CYP4A22)、固醇載體蛋白2基因(SCP2)和酰基輔酶A氧化酶1基因(ACOX1)參與脂肪酸氧化；載脂蛋白A1基因(APOA1)、硬脂酰輔酶A去飽和酶基因(SCD5)和基質(zhì)金屬蛋白酶1基因(MMP1)分別參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、脂肪生成和脂肪細胞分化。在奶牛中,脂類代謝對于維持適當?shù)纳彻δ苤陵P(guān)重要,而產(chǎn)后早期,脂代謝會受到負能量平衡的影響,這歸因于脂肪儲備的調(diào)動增加,以釋放牛奶生產(chǎn)所需的能量[18-19]。

蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase, MDH)根據(jù)分布不同而有不同的命名,分布在動物體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的為細胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶(Cytoplasmic malate dehydrogenase, MDHⅠ),分布在動物體線粒體的為線粒體蘋果酸脫氫酶(Mitochondrial malate dehydrogenase,MDHⅡ)[20]。MDHⅠ屬于親水性的穩(wěn)定蛋白；MDHⅡ能夠在三羧酸(TCA)循環(huán)中催化蘋果酸和草酰乙酸,在線粒體基質(zhì)的氧化還原控制過程中起重要作用,參與調(diào)節(jié)TCA循環(huán)[21-23]。此外,MDHⅡ活性與線粒體內(nèi)膜上的蘋果酸/草酰乙酸交換密切相關(guān)；在線粒體中甘氨酸氧化期間產(chǎn)生的NADH,在過氧化物酶體中將羥基丙酮酸還原為甘油酸消耗[24]。青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省、教育部重點實驗室前期對牦牛MDHⅠ基因進行組織表達分析,發(fā)現(xiàn)其在臀脂上表達量顯著高于心臟、肝臟、肺臟等組織,推測該基因參與牦牛脂代謝調(diào)控[21],而MDHⅡ基因脂代謝研究在牦牛上未見報道。本次試驗首次克隆了牦牛MDHⅡ基因,結(jié)合組織表達譜與脂代謝候選基因相關(guān)性分析,揭示該基因與脂代謝候選基因關(guān)系,為進一步研究高原動物脂代謝機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 組織樣采集

于西藏自治區(qū)昌都市類烏齊縣,選取4 個年齡段(0.5,2.5,4.5,7.5歲),每個年齡段各3 頭健康的類烏齊牦牛,用DEPC水沖洗采集到的心臟、肝臟、肺臟、臀肌和臀脂組織,隨后用錫箔紙包裝并迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 牦牛MDHⅡ基因克隆及表達

1.2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 用TRIzol法提取類烏齊牦牛心臟、肝臟、肺臟、臀肌和臀脂組織的總RNA,其濃度用紫外分光光度計檢測,純度用瓊脂糖凝膠電泳檢測,分裝標記后置于-80 ℃的超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,分裝標記后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計及擴增 根據(jù)GenBank上野牦牛MDHⅡmRNA序列(XM_005892826.2),用Primer Premier 5.0設(shè)計引物并擴增牦牛MDHⅡ基因的CDS區(qū)；引物序列為F：5′-TGTGGAGGTCGTTG GAGT-3′,R：5′-CCTCCTCAACGAAGCAAA-3′,由成都擎科生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)： ddH2O 9.5 μL、上游引物1 μL(10 pmol/μL)、下游引物1 μL(10 pmol/μL)、cDNA模板1 μL(200～600 ng/μL)、Taq Green PCR Master Mix 12.50 μL(0.625 U)。

PCR擴增條件：預(yù)變性2 min(95 ℃)；變性30 s(95 ℃),退火30 s(53.9 ℃),延伸1 min 30 s(72 ℃),33次循環(huán)；終延伸5 min(72 ℃)；產(chǎn)物保存(4 ℃)。

1.2.3 膠純化及菌落培養(yǎng) 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物、DNA純化試劑盒(TianGen公司)進行純化膠回收,然后連接到pMD19-T載體(TaKaRa公司)上,經(jīng)過16 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞(大腸桿菌)中,涂布器涂于含Amp+的LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃倒置培養(yǎng)10～12 h。將篩選出的陽性克隆置于含Amp+的LB液體培養(yǎng)基(7 mL)中,37 ℃振蕩培養(yǎng)10～12 h。

1.2.4 菌液擴增及目的基因測序 菌液振蕩培養(yǎng)后進行PCR鑒定(PCR擴增體系及條件與引物擴增相同),最后利用質(zhì)粒提取盒(TianGen公司)提取質(zhì)粒,交由成都擎科生物科技有限公司進行測序鑒定。

1.2.5 組織表達譜分析 用克隆得到目的片段設(shè)計實時熒光定量特異性引物。該引物序列為F：5′-AGCCGCTTTCGCTTCTT-3′,R：5′-CAGCCCTTCAGG CAATCT-3′；內(nèi)參基因(GADPH)引物序列為F：5′-CCACGAGAAGTATAACAACACC-3′,R：5′-GTCATA AGTCCCTCCACGAT-3′。

實時熒光定量反應(yīng)體系(10 μL)：5 μL TB Green Premix Ex TaqTMⅡ、上下游引物各0.4 μL、無菌去離子水3.2 μL、cDNA模板1.0 μL。

定量程序：預(yù)變性30 s(95 ℃)；變性5 s(95 ℃),退火30 s(55 ℃),延伸30 s(72 ℃),39 個循環(huán)。

目的基因的表達量用2-ΔΔCT法計算,內(nèi)參基因(GAPDH)對樣本定量結(jié)果進行處理,結(jié)果用平均值±標準差(Mean±s)表示；顯著性分析選擇One-way ANOVA和t-檢驗。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 對克隆得到的牦牛MDHⅡ基因序列進行生物信息學(xué)分析[21]。

1.3 脂代謝關(guān)聯(lián)性分析

表1 脂代謝候選基因引物序列Tab.1 Lipid metabolism candidate gene primer sequences

根據(jù)GenBank上公布的普通牛脂代謝候選基因,隨機選取12 個基因[25](表1),根據(jù)GenBank上公布的普通牛的序列(表1),利用Primer Premier 5.0設(shè)計實時熒光定量特異性引物,檢驗其特異性并設(shè)計溫度梯度尋找最佳退火溫度(表1),根據(jù)12 頭牦牛的臀肌和臀脂組織的表達量,分析MDHⅡ基因與脂代謝相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)性。反應(yīng)體系、定量程序與計算方法同上；選擇One-way ANOVA和t-檢驗進行顯著性分析,利用皮爾森系數(shù)法分析相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛MDHⅡ基因的克隆及表達

2.1.1 牦牛MDHⅡ基因PCR擴增結(jié)果 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,PCR擴增產(chǎn)物條帶單一,且大小與目的片段大小一致(圖1),MDHⅡ基因DNA序列長為1 196 bp。

M.Marker D2000；1.擴增電泳條；2.菌液PCR電泳條帶。M.Marker D2000；1.Amplification electrophoresis band；2.Bacterial fluid PCR strip.

對克隆所得牦牛MDHⅡ基因序列(MN592795)進行開放性閱讀框分析(ORF Finder 在線程序),結(jié)果顯示，牦牛MDHⅡ基因CDS區(qū)長1 017 bp,編碼338 個氨基酸。

2.1.2 相似性、系統(tǒng)進化樹分析 利用DNAStar軟件中的MegAlign對牦牛MDHⅡ基因與其他物種進行相似性比較。結(jié)果(表2)顯示,牦牛MDHⅡ基因與普通牛(XM_005225008.3)、野豬(NM_001244153.1)的相似性最高,分別是83.3%和72.0%；其次是家貓(NM_001278853.1)、黑猩猩(XM_001156205.4)、獼猴(XM_015133288.2)、小家鼠(NM_008617.2)和人(NM_001282403.2),分別為69.0%,68.7%,68.5%,64.9%和60.8%；相似性較低的是原雞(XM_415765.6)、青鱂(XM_004077775.4)、非洲爪蛙(NM_001006693.2)和果蠅(NM_142439.3),分別為58.4%,56.7%,55.1%和 53.0%。

通過MEGA 5.2構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,顯示牦牛與普通牛親緣性最近；其次為野豬和家貓,與果蠅親緣性最遠(圖2)。

表2 牦牛與11個物種MDHⅡ基因的序列同源性比對Tab.2 Sequence homology alignment of yak and 11 species MDHⅡ genes

圖2 牦牛MDHⅡ基因核苷酸序列系統(tǒng)進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of nucleotide sequence of yak MDHⅡ gene

2.1.3 組織表達分析 組織表達分析結(jié)果顯示,MDHⅡ基因在牦牛各年齡段中,心臟和肺臟的表達水平顯著高于臀肌和臀脂組織,且隨著年齡的增長,其在各組織中的表達水平逐漸下降,每個年齡段各組織的表達趨勢基本一致(圖3)。MDHⅡ基因在牦牛的心臟和肺臟組織中表達水平較高,在臀肌中最低；在心臟中的表達水平顯著高于肝臟、臀肌和臀脂組織的表達水平,在肺臟中的表達水平顯著高于臀肌和臀脂組織的表達水平(圖4)。

A. 0.5歲；B. 2.5歲；C. 4.5歲；D. 7.5歲。相同字母表示不具有顯著性差異(P>0.05),不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖4同。A. 0.5 years；B. 2.5 years；C. 4.5 years；D. 7.5 years.The same letters indicate no significant difference (P>0.05), and different letters indicate significant difference (P<0.05).The same as Fig.4.

圖4 牦牛MDHⅡ基因的mRNA組織表達分析Fig.4 mRNA expression analysis of yak MDHⅡ gene

2.2 牦牛MDHⅡ基因與脂代謝相關(guān)基因的相關(guān)性分析

2.2.1 脂代謝候選基因組織表達 由圖5可知,選取的12 個脂代謝候選基因中,除FABP2和VLDLR基因外,其余10 個基因在臀脂中的表達量均高于臀肌。

2.2.2 脂代謝候選基因與MDHⅡ基因相關(guān)性分析 在臀肌組織中,脂代謝候選基因的表達量與MDHⅡ基因沒有相關(guān)性；在臀脂組織中,MDHⅡ基因表達量與CPT1呈顯著負相關(guān)(表3)。

圖5 牦牛脂代謝候選基因的mRNA組織表達分析Fig.5 mRNA tissue expression analysis of yak lipid metabolism candidate genes

3 討論與結(jié)論

MDH具有氧化還原性,參與三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán),廣泛分布在動物體各個組織中,控制著動物的呼吸代謝。有研究發(fā)現(xiàn)蜜蜂中MDH有3個區(qū)帶,分別為MDHⅠ、MDHⅡ和MDHⅢ[26]；雞的MDH基因5′側(cè)翼區(qū)235 bp處的SNP位點可作為影響其生長性狀的主效基因[27]；MDH基因的SNPs(T253C)可作為控制京海黃雞脂肪性狀的主效基因[28]；豬背膘外層脂肪中MDH活性會影響肉用性狀的選育[29]。近年來,MDHⅡ基因在醫(yī)學(xué)上也被廣泛研究,其被鑒定為新的嗜鉻細胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤易感基因；兒童的嚴重神經(jīng)學(xué)臨床表現(xiàn)也與該基因的功能喪失有關(guān)[30-31]。本試驗對牦牛MDHⅡ基因進行了克隆表達分析,分析其與脂代謝候選基因的相關(guān)性,為該基因在肌內(nèi)脂肪代謝相關(guān)研究提供參考資料。

表3 脂代謝候選基因與MDHⅡ基因在牦牛臀肌和臀脂組織中表達量相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between the expression of lipid metabolism-related genes and MDHⅡgene in yak gluteal muscle and gluteal fat tissue

注：*表示具有顯著相關(guān)性(P<0.05)。

Note：*indicate significant correlation(P<0.05).

本試驗成功克隆牦牛MDHⅡ基因,全長序列為1 196 bp,CDS區(qū)序列為1 017 bp,編碼338 個氨基酸。系統(tǒng)進化樹分析得到該基因進化上相對不保守,說明MDHⅡ為適應(yīng)環(huán)境變化在不同物種上的遺傳特性隨之變化。線粒體是機體進行有氧呼吸氧化磷酸化的場所,是機體的“供熱站”。圍繞線粒體開展不同物種高原適應(yīng)性的研究也成為研究者關(guān)注的熱點之一。Torroni等[32]發(fā)現(xiàn)高海拔地區(qū)人群與低海拔地區(qū)人群相比具有50%以上的特異性mtDNA,推測mtDNA變異可能是影響生物高原適應(yīng)性的重要因素之一。另有研究顯示,牦牛心肌和骨骼肌中的線粒體抗氧化能力隨著海拔的升高而增強,得到牦牛線粒體參與了牦牛的高原適應(yīng)性機制的結(jié)果[33]。牦牛為適應(yīng)高原環(huán)境,肺臟質(zhì)量為其體質(zhì)量的1.1%～1.7%,且肺泡數(shù)目多,體積小,單位面積內(nèi)的肺血管數(shù)目較多,心臟的質(zhì)量占其體質(zhì)量的0.5%～0.8%[34]。在本次研究中發(fā)現(xiàn)牦牛MDHⅡ基因主要分布在線粒體內(nèi),且在心臟和肺臟的表達量高于其他組織,推測該基因可能與牦牛的低氧適應(yīng)性機制有關(guān)。

研究表明,MDH基因編碼的氧化還原酶參與機體內(nèi)部調(diào)節(jié)和肌肉、脂肪組織的能量代謝,但關(guān)于該基因參與脂代謝調(diào)節(jié)在牦牛上的研究還未見報道[35]。本試驗組織表達分析結(jié)果顯示,MDHⅡ基因在牦牛各年齡段(除0.5歲)組織中表達趨勢相對一致；隨著年齡增長,各組織的表達量呈下降趨勢。可能是幼年時,機體各組織和器官處于生長發(fā)育階段,導(dǎo)致MDHⅡ表達量較高,且期間脂肪生長速率要高于肌肉生長速率,肌肉生長處于相對停滯狀態(tài),故牦牛0.5歲時,臀脂的表達量要高于其他年齡段,但臀肌的表達量沒有顯著變化,也可能是由于試驗誤差導(dǎo)致的結(jié)果,但總體看來牦牛臀脂的表達量要高于臀肌。

關(guān)于脂代謝候選基因研究顯示,過氧化物酶體增殖物激活受體亞型β/δ(PPARβ/δ)通過調(diào)節(jié)VLDLR水平影響血清甘油三酸酯水平；VLDL-VLDLR信號增加會加重肥胖中的脂肪組織炎癥和胰島素抵抗[36-37]。ACACA的多態(tài)性與豬、奶牛、羊的脂肪沉積密切相關(guān),能夠作為其遺傳選育的分子的標記[38-39]。在脂肪細胞中,脂蛋白脂酶(LPL)是影響三?；视头纸飧视秃椭舅崴俾实目刂泼竅40]。肉雞中的LPL活性隨日齡的增加而增加,該基因的多態(tài)性可作為肉牛生長性狀的分子標記[41]。Han等[42]發(fā)現(xiàn)在非反芻細胞中,裂解激活蛋白(SCAP)能夠促進SREBP1的核轉(zhuǎn)位和FASN基因轉(zhuǎn)錄的激活,從而促進牛乳腺上皮細胞中的脂滴形成。本試驗通過對脂代謝候選基因與牦牛MDHⅡ基因在臀肌和臀脂中的表達水平進行皮爾森系數(shù)分析,得到該基因與脂代謝候選基因肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT1)的表達水平顯著相關(guān),與其他脂代謝候選基因的表達水平無顯著相關(guān)性,推測可能是因為不同基因在同一組織中有不同的表達水平,亦可能MDHⅡ基因本身與其他候選基因沒有相關(guān)性。Keung等[43]研究表明,抑制CPT1表達會增加了體內(nèi)碳水化合物的利用,同時可降低脂肪酸的利用；宋銘琪等[44]研究指出CPT1可能參與大口黑鱸機體脂肪的分解代謝；梁計峻等[45]研究認為CPT1A可能在山羊肌內(nèi)脂肪沉積過程中具有重要調(diào)控作用。同時,MDH在脂肪合成中有重要作用,其能夠催化動物體內(nèi)蘋果酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸并產(chǎn)生NADPH,因此MDHⅡ基因能夠作為豬的脂代謝候選基因[46-47]。綜上所述,MDHⅡ基因可能參與牦牛脂代謝過程,但具體作用分子機制和功能需要進一步試驗驗證。

本試驗首次克隆了牦牛MDHⅡ基因,序列全長為1 196 bp,CDS區(qū)全長為1 017 bp,編碼338 個氨基酸,在心臟上表達量高,且在脂肪組織中具有較高表達量；與脂代謝候選基因CPT1具有顯著相關(guān)性,推測該基因可能參與牦牛脂代謝過程,為今后進一步研究牦牛質(zhì)代謝機制提供了參考資料。