易紅梅,任 潔,王 璐,王 蕊,葛建镕,王鳳格,趙久然,徐明良

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家玉米改良中心,北京 100094；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 玉米研究中心,玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室,北京 100097)

玉米目前是全球第一大作物,也已躍升為我國第一大作物,經(jīng)濟地位和戰(zhàn)略地位日益提升,成為政府保證糧食持續(xù)增產(chǎn)的最大戰(zhàn)略需求。隨著我國種業(yè)的快速發(fā)展,玉米審定品種數(shù)量呈逐年上升趨勢,目前我國已通過國家或省級審定的品種近1.3萬個(截止到2019年),尤其是近幾年隨著深化種業(yè)“放、管、服”,激發(fā)育種人員快速釋放科技創(chuàng)新積極性,新品種審定進入了快車道,2016-2019年審定玉米品種近5 700個,國家及各省區(qū)試、聯(lián)合體、綠色通道參試品種數(shù)量每年接近8 000個。隨著玉米品種數(shù)量逐年增多,少數(shù)骨干親本的集中應(yīng)用,品種間的遺傳差異越來越小,難以進行有效甄別,如何從源頭控制品種多、亂、雜,并有效地管理和甄別數(shù)量龐大的玉米品種成為管理的難題[1]。

我國從2002年起開始開展DNA指紋在國家玉米區(qū)域試驗樣品真實性檢測中的研究與應(yīng)用[2-3],2005年遼寧、吉林、河北、河南、山東、四川等重要玉米種植地區(qū)開始采用DNA檢測參試組合真實性,2012年基本覆蓋到全國各省、自治區(qū)。2016年隨著農(nóng)作物品種審定制度的改革和參試渠道的擴寬,國家區(qū)試和國家聯(lián)合體、省區(qū)試和省聯(lián)合、綠色通道、自主試驗等參試渠道參試的組合數(shù)量出現(xiàn)了爆發(fā)式的增長,2002年至今已累計檢測42 826個玉米參試組合樣品的DNA真實性。水稻[4]、小麥[5-6]、大豆[7-8]、油菜[9-10]、棉花[11]、馬鈴薯[12]、花生[13]、芝麻[14]等作物區(qū)域試驗也在采用DNA指紋技術(shù)對參試組合進行檢測,并作為品種審定的依據(jù)和參考。

分子標記在區(qū)域試驗參試組合檢測中發(fā)揮以下作用：一是構(gòu)建參試組合DNA指紋數(shù)據(jù)庫,分析參試組合的遺傳多樣性以及品種選育趨勢；二是檢測同一參試組合不同年份、不同組別是否存在同名更換；三是對每一份參試組合進行特異性檢測,與所有已知品種及同時參試的組合進行比對,從分子水平檢測是否具備特異性；四是對參試組合進行一致性、穩(wěn)定性、純度測試。DNA指紋在我國品種區(qū)域試驗中的深入應(yīng)用,為我國品種管理提供了有效的技術(shù)支撐,防止參試組合更換親本,以及與已知品種相近的問題,從源頭解決品種的多、亂、雜的問題。本研究對2014-2019年國家玉米區(qū)域試驗樣品進行DNA指紋的檢測和遺傳多樣性分析,全面了解我國近幾年國家玉米參試組合的多樣性、選育水平、發(fā)展趨勢和存在的問題。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2014-2019年國家區(qū)試參試組合2 949份,其中2014年294份,2015年430份,2016年524份,2017年576份,2018年538份,2019年587份。包括青貯組(QZ)、西南組(XN)、東南組(DN)、爆裂組(BL)、極早熟組(JZS)、東華北組(DHB)、西北組(XB)、黃淮海組(HHH)、鮮食玉米組(包括甜玉米和糯玉米)(XS)、機收組(JS)、熱帶和亞熱帶組(RD)。樣品信息詳見表1,其中鮮食玉米組參試組合包括糯玉米和甜玉米,雖然甜玉米與糯玉米的遺傳背景不同,但兩者與其他組別遺傳背景差異較大,合并為鮮食組進行分析。

表1 樣品信息表Tab.1 Sample information sheet

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 每份供試樣品均隨機抽取50粒種子形成混合樣品,采用CTAB法提取DNA。

1.2.2 PCR擴增 模板DNA 3 μL,0.25 μmol/L引物,1×PCR Buffer,0.15 μmol/L dNTP,2.5 μmol/L MgCl2,1 UTaq酶,反應(yīng)總體積為20 μL。每對引物中的一條5′端用熒光染料標記,選用PET、NED、VIC、FAM 4種熒光染料(Applied Biosystems, USA公司合成)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min,1個循環(huán)；94 ℃變性40 s,60 ℃退火35 s,72 ℃延伸45 s,共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.3 檢測擴增產(chǎn)物 毛細管電泳：PCR產(chǎn)物在毛細管熒光電泳系統(tǒng)ABI 3730XL DNA分析儀 (Applied Biosystems,USA)上進行電泳,在96孔電泳板的單個孔中分別加入1.5 μL PCR產(chǎn)物、9 μL甲酰胺、0.1 μL分子量內(nèi)標(GeneScanTM-500 LIZ)。95 ℃變性5 min,4 ℃保存10 min,1 000 r/min離心1 min后,于AB 3730XL DNA分析儀上進行電泳。預(yù)電泳時間為15 kV,2 min；電泳時間為15 kV,20 min。用Date Collection V1.0軟件收集原始數(shù)據(jù)。

1.2.4 真實性檢測 參試組合真實性檢測參考NY/T 1432-2014《玉米品種鑒定規(guī)程 SSR標記法》。參試組合近似品種篩查對照樣品庫包括6 039份農(nóng)業(yè)部征集審定品種標準樣品、1 861份農(nóng)業(yè)部品種權(quán)保護標準樣品、同年度及上一年度的參試樣品。

1.2.5 遺傳分析 采用PowerMarker V3.25軟件對等位變異數(shù)、基因多樣性、雜合率和多樣性信息(Polymorphism information content, PIC)進行分析,基于UPGMA(Unweighted pair-group method with arithmetic means)方法的Nei′s (1972)遺傳距離進行不同區(qū)組的聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年份和不同區(qū)組多樣性的比較

不同年份參試組合多樣性分析結(jié)果表明(表2),2014-2019年國家區(qū)試參試組合年際間的PIC、雜合率和遺傳多樣性基本一致,由于2014和2015年樣品數(shù)量較少,2014和2015年參試組合的平均基因型數(shù)略低于2016-2019年。不同組別參試組合多樣性分析結(jié)果表明(表3),爆裂組和西北組的PIC和遺傳多樣性較低,尤其是爆裂組,各指標都低于其他組別；鮮食、青貯和西南3個組別的PIC和遺傳多樣性較高。

表2 2014-2019年不同年份參試組合多樣性比較Tab.2 Genetic diversity comparison of national regional trail in 2014-2019

表3 不同區(qū)組參試組合多樣性比較Tab.3 Genetic diversity comparison among different regional trail group

2.2 不同區(qū)組之間的遺傳距離與聚類分析

分析各區(qū)組之間的遺傳距離和遺傳聚類圖,結(jié)果(表4、圖1)表明,爆裂組與其他區(qū)組遺傳距離最遠,遺傳聚類時單獨成群,其次是熱帶亞熱帶、鮮食和極早熟組,東華北和西北之間遺傳距離最小。機收組分為機收東北組和機收黃淮海組,2個不同區(qū)域機收組之間的遺傳差異低于2個區(qū)域的常規(guī)品種。黃淮海、東華北、西北、機收幾個組別之間遺傳背景有一定的差異,但遺傳背景相似比例明顯高于其他組別。

表4 不同組別之間的Nei′s(1972)遺傳距離Tab.4 Nei′s (1972) genetic distance among different regional trail groups

圖1 不同區(qū)組之間基于UPGMA法的Nei′s遺傳聚類圖Fig.1 UPGMA cluster diagram of different trail group (Nei′s)

2.3 參試組合DNA指紋檢測與分析

2014-2019年2 949份參試組合共檢測出1 152組同名組合,其中1 088組不同來源的同名組合DNA指紋一致,64組不同來源的同名組合DNA指紋差異位點≥2,說明親本組合發(fā)生更換,更換組合的樣品占比2.17%。更換組合的樣品與對照差異位點大部分在6個以上,表明大部分更換的組合與原組合差異明顯。2 949份參試組合與已審定、品種權(quán)保護、同一年度及上一年度參試組合比較,共篩查出187套相似品種信息,即6.30%的參試組合與其他品種或組合DNA指紋無明顯差異,西北組、東華北組和黃淮海組篩查出的相似品種比例較高,分別為12.90%,10.30%,7.80%,東南組、鮮食組和爆裂組篩查出的相似品種比例較低,分別為1.50%,0.70%,0(圖2)。

圖2 不同區(qū)組篩查出的近似品種比例Fig.2 Proportion of similar varieties detected in different groups

2.4 參試樣品與數(shù)據(jù)庫比較差異位點分布

2014-2019年國家區(qū)試參試組合與已審定品種、品種權(quán)保護品種以及同一年度和上一年度所有參試組合兩兩比對,年際間隨機2個品種的差異位點的分布基本一致,主要分布在28～36個位點之間,表明參試組合整體具有較高的多樣性(圖3)。2014-2019年的參試組合與數(shù)據(jù)庫比對篩查最近似品種,DNA指紋差異位點在5個以內(nèi)的品種數(shù)呈逐漸下降趨勢,表明遺傳背景相近的品種比例逐年降低。與數(shù)據(jù)庫比較篩查每個參試組合的最近似品種信息,2014年參試組合與最近似品種比較,頻率最高的DNA指紋差異位點為16個,2015-2016年為15個,2017-2019年為13個,表明參試組合之間及與已知品種遺傳背景相似性逐年提高(圖4)。

圖3 不同年份國家區(qū)試參試組合間差異位點數(shù)分布 Fig.3 Distribution of the number of differential sites among the national regional trail varieties in different years

圖4 不同年份參試組合與最近似品種比較差異位點分布Fig.4 Distribution of the most similar variety difference sites in different years

3 結(jié)論與討論

3.1 2014-2019年國家區(qū)試參試組合遺傳背景的變化趨勢

本研究結(jié)果表明,隨著玉米區(qū)域試驗持續(xù)采用DNA指紋進行檢測同名更換和非同名相近的問題,遺傳背景相近的參試組合比例在逐年降低,表明直接拿其他品種換名參試或進行高度模仿育種的比例在減少,DNA指紋的持續(xù)監(jiān)控能從源頭發(fā)揮清理品種多、亂、雜的作用。與王鳳格等[15]研究結(jié)果比較,本研究分析的2014-2019年國家區(qū)試參試組合的基因型數(shù)量、等位基因數(shù)量、基因多樣性、PIC、雜合率均有所提高,表明近10 a來我國玉米選育品種遺傳變異和遺傳多樣性日趨豐富。2014-2019年不同年際間國家區(qū)試玉米參試組合之間遺傳多樣性和差異位點分布基本一致,說明近幾年國家區(qū)域試驗參試組合遺傳多樣性變化不大,但參試組合與數(shù)據(jù)庫比對最近似品種的差異位點數(shù)在減少,側(cè)面反映了近幾年來,其他來源參試組合的遺傳背景相似度提高了,表明參試組合的激增并未帶來種質(zhì)的創(chuàng)新,參試組合間的遺傳背景在逐漸變窄。在不同區(qū)組的參試組合中,爆裂組的參試組合多樣性水平最低,可能是由于爆裂玉米參試品種參試單位和參試品種較少,關(guān)鍵種質(zhì)資源相似所致。

3.2 DNA指紋在玉米區(qū)域試驗中的應(yīng)用

區(qū)域試驗是品種審定的重要依據(jù),近幾年我國玉米參試組合數(shù)量年均達到8 000份,如何準確檢測每個品種是否具有特異性,是我國目前品種管理面臨的難題,也給DNA指紋技術(shù)在區(qū)域試驗中的應(yīng)用帶來了挑戰(zhàn)。雖然2014-2019年檢測出的近似品種比率呈現(xiàn)逐年下降的趨勢,但由于參試組合數(shù)量的大幅增加,每年檢測出的DNA指紋相近的品種的絕對數(shù)量增加幅度較大。隨著分子標記輔助育種技術(shù)的不斷發(fā)展,以及轉(zhuǎn)基因、基因編輯品種的研發(fā),在原有優(yōu)異品種基礎(chǔ)上進行微改良的新品種成為DNA鑒定的難點。隨著我國知識產(chǎn)權(quán)保護力度的不斷增加,為了鼓勵原始創(chuàng)新,行業(yè)內(nèi)有人士提出將現(xiàn)行行業(yè)標準DNA指紋差異位點判定閾值從“2”調(diào)整到“4”。根據(jù)近年國家及各省區(qū)試、聯(lián)合體、綠色通道的參試品種信息,SSR差異位點每提高1個將影響約5%的參試組合,根據(jù)近幾年的參數(shù)組合數(shù)量計算,1個位點將影響約400個參試組合。DNA指紋差異位點閾值的調(diào)整對我國玉米品種選育影響較大,差異位點的提高能抑制大量品種同質(zhì)化的問題,提高品種原始創(chuàng)新水平。面對新技術(shù)、新形式的挑戰(zhàn),需要不斷發(fā)展和完善DNA指紋技術(shù)。

3.3 SNP技術(shù)在玉米區(qū)域試驗中的應(yīng)用展望

由于SSR只采用了40個位點進行檢測,對相似品種的遺傳背景掃描標記密度較低,每個位點占比2.50%,不能精確評估相似品種間的遺傳關(guān)系。SNP作為新一代DNA指紋技術(shù),與其他遺傳標記相比,SNP具有以下幾個突出的優(yōu)勢：一是在基因組中標記密度更高,分布也更均勻,候選位點多；二是SNP通常為二態(tài)位點,數(shù)據(jù)統(tǒng)計容易,不同來源數(shù)據(jù)易實現(xiàn)整合和共享,而且試驗流程易于自動化；三是單個位點基因分型成本較低；四是具有高通量樣品和高通量位點檢測的優(yōu)勢。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展,SNP基因分型成本越來越低,各種SNP基因分型平臺已廣泛應(yīng)用于遺傳研究和分子標記輔助育種中,包括基于芯片的多位點SNP檢測,單SNP基因分型和測序。SNP芯片具有高密度的位點,能更精準地評估相似品種間的遺傳背景,適用于區(qū)域試驗參試組合的特異性篩查。目前多種作物已開發(fā)不同通量的SNP芯片[16-21],我國已開發(fā)出200K、90K、60K、55K、3 072、384等不同通量的玉米SNP芯片。建議加快SNP芯片鑒定技術(shù)在各農(nóng)作物品種區(qū)域試驗中的應(yīng)用研究,為區(qū)域試驗品種真實性和特異性檢測提供更有效的技術(shù)方案。