杜艷偉,王高鴻,李顏方,趙根有,閻曉光,王振華,王玉文,余愛(ài)麗,趙晉鋒

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 谷子研究所,特色雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 長(zhǎng)治 046011)

光合作用是決定作物產(chǎn)量的最重要因素之一,作物中大約90%的干物質(zhì)直接源于光合作用[1],因此,光合效率的高低直接關(guān)系到作物產(chǎn)量的高低。與C3作物相比,C4作物具有光合速率高,CO2補(bǔ)償點(diǎn)低、光呼吸弱的優(yōu)點(diǎn),尤其是在強(qiáng)光、高溫、干旱等不利條件下,C4植物更具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)[2]。丙酮酸磷酸雙激酶(Pyruvate orthophos phate dikinase,PPDK)是C4植物光合途徑中的一個(gè)關(guān)鍵限速酶[3-4],其催化固定CO2最初受體磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)再生。PPDK主要有葉綠體型和胞質(zhì)型2種類型,其中,葉綠體型PPDK催化的是一個(gè)可逆反應(yīng),在葉綠體中該反應(yīng)主要向著形成PEP的方向進(jìn)行；胞質(zhì)型PPDK則在PEP傳遞、CO2呼吸、氨基酸互換及淀粉合成等過(guò)程中具有重要作用[5-6]。在非光合作用中,PPDK在保持植物體內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)、為生物合成和抗氧化系統(tǒng)提供氨基酸與其他化合物方面發(fā)揮積極作用[7]。PPDK在C4植物葉綠體基質(zhì)中大量存在,主要在葉肉細(xì)胞的葉綠體中行使功能,而在維管束鞘細(xì)胞、根、莖等其他組織中表達(dá)量極低。在C3植物中,PPDK主要存在于未成熟種子、根、胚芽鞘和葉片中[8-9],但由于其中PPDK的表達(dá)量很低,對(duì)其功能還知之甚少[10-12]。前人關(guān)于C4植物中PPDK在非生物脅迫下的功能進(jìn)行了一些研究,玉米體內(nèi)的葉綠體型PPDK在溫度低于12 ℃時(shí)會(huì)失去活性[13]；葦子草PPDK在低溫(14 ℃)下作為限速酶對(duì)維持其光合效率起主要作用[7]。另外,PPDK還具有一定的抗鹽能力[14],在鹽漬處理下玉米苗期葉肉細(xì)胞中PPDK的活性顯著增強(qiáng)[15]。在陽(yáng)光UV-B輻射及補(bǔ)充UV-B輻射的條件下,玉米PPDK表達(dá)量上升,但是在溫室中補(bǔ)充UV-B,其表達(dá)量下調(diào)[7]。胞質(zhì)型PPDK與脅迫的關(guān)系也有報(bào)道,但主要集中在低氧、缺水、高溫及生物脅迫。此外,PPDK在基因結(jié)構(gòu)[16-18]、進(jìn)化關(guān)系[19]、功能[20-23]、調(diào)控機(jī)制[10,24-25]、基因工程[18,26-28]等方面也有一定的研究。

谷子(Setariaitalica(L.) Beauv)是我國(guó)北方干旱和半干旱地區(qū)重要的糧食作物,具有抗旱、耐瘠、適應(yīng)性廣等特性。谷子基因組測(cè)序已完成并公布,為開(kāi)展谷子抗逆分子生物學(xué)研究提供了極為便利的條件[29-30],但是,迄今為止,PPDK與非生物逆境脅迫的相關(guān)研究在C4作物谷子中還鮮有報(bào)道。

本研究為探索PPDK基因在谷子逆境應(yīng)答中的功能,對(duì)SiPPDK2蛋白特征、氨基酸序列、功能、亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子區(qū)域順勢(shì)應(yīng)答元件等參數(shù)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè),進(jìn)一步檢測(cè)PPDK基因在苗期逆境脅迫下的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式及在拔節(jié)、抽穗、灌漿 3 個(gè)生育時(shí)期干旱脅迫和不同光照處理下的表達(dá)情況。研究結(jié)果可為進(jìn)一步分析PPDK基因在谷子逆境應(yīng)答信號(hào)途徑中的功能和機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用谷子品種豫谷1號(hào)為試驗(yàn)材料,種子由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所谷子基因課題提供。

待植株長(zhǎng)至三葉期時(shí)進(jìn)行干旱(20% PEG6000)、鹽 (250 mmol/L NaCl)、ABA(100 μmol/L)和低溫(4 ℃)處理,分別處理0,1,3,6,12,24 h,整株取樣,取樣后液氮速凍,于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?分析非生物逆境脅迫下谷子苗期SiPPDK2的表達(dá)量差異。

旱棚設(shè)對(duì)照(正常澆水)和干旱(澆3次關(guān)鍵水)2個(gè)處理；旱棚光照試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理,光照Ⅰ(用黑色遮陽(yáng)網(wǎng)遮擋1層)和光照Ⅱ(用黑色遮陽(yáng)網(wǎng)遮擋2層),旱棚其他管理措施同大田。葉片取樣分別在拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期進(jìn)行,設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。取樣后液氮速凍,于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?分析不同生育期干旱脅迫及不同光照強(qiáng)度下的SiPPDK2的表達(dá)量差異。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因的結(jié)構(gòu)與序列分析 氨基酸數(shù)目、相對(duì)分子量以及等電點(diǎn)等理化性質(zhì)分析用EXPASY軟件(http://web.expasy.org/protparam/)[31]進(jìn)行；啟動(dòng)子順式元件分析利用在線軟件plantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)完成；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)用Psort在線工具進(jìn)行；基因序列比對(duì)使用ClustalX 1.83軟件[32]完成；不同物種NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)采用Mega 6.0軟件鄰接法構(gòu)建[33]。

1.2.2 總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量分析 植物RNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司,總RNA提取按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。SiPPDK2和內(nèi)參基因SiGAPB特異性引物用PrimerPrimer 5.0軟件設(shè)計(jì)。SiPPDK2上游引物：5′-GTGCTCAACCT GGGACTCAA-3′,下游引物：5′-AGGCAGTCAGGT CATTGTCG-3′；SiGAPB上游引物：5′-CAGTGGACG CACAACAGGTAT-3′,下游引物：5′-AGCAAGGT CAAGACGGAGAAT-3′。樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,均一化后作為實(shí)時(shí)定量PCR模板。反應(yīng)體系為20 μL：10 μL熒光染料、7.2 μL無(wú)菌水、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、2 μL cDNA。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 7 s,57 ℃ 10 s,72 ℃ 15 s,45個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理3次重復(fù),相對(duì)定量采用2-ΔΔCt法計(jì)算[34]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007作圖,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiPPDK2基因的生物信息學(xué)分析

2.1.1SiPPDK2基因的鑒定 序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),SiPPDK2位于谷子3號(hào)染色體21 259 472-21 273 920區(qū)域。功能域分析顯示,SiPPDK2蛋白含有2個(gè)N端的磷酸烯醇式丙酮酸結(jié)構(gòu)域,位于蛋白的91-363位置和375-428位置；含有1個(gè)磷酸烯醇式丙酮酸結(jié)構(gòu)域,位于蛋白的495-575 位置；含1個(gè)C端的磷酸烯醇式丙酮酸結(jié)構(gòu)域,位于蛋白的590-943位置,這些結(jié)構(gòu)都屬于PPDK家族基因的基本特征。綜合說(shuō)明SiPPDK2基因是谷子PPDK家族成員。

2.1.2 SiPPDK2蛋白特性預(yù)測(cè)與亞細(xì)胞定位分析 采用EXPASY軟件對(duì)SiPPDK2的蛋白特性進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)結(jié)果(表1)顯示,T01和T02編碼相同的氨基酸,分子量為1 024.249 4 ku,等電點(diǎn)為5.38,分子式為C4496H7188N1264O1375S46,不穩(wěn)定指數(shù)為36.69,脂肪系數(shù)為85.26,平均疏水性指數(shù)為-0.168；T03分子量為957.603 5 ku,等電點(diǎn)為5.03,分子式為C4216H6709N1161O1291S45,不穩(wěn)定指數(shù)為33.67,脂肪系數(shù)為86.70,平均疏水性指數(shù)為-0.136。利用 GSDS 在線軟件對(duì)SiPPDK2基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,結(jié)果如圖1所示,SiPPDK2基因含有18個(gè)內(nèi)含子(圖1)。另外,檢索發(fā)現(xiàn),SiPPDK2有3個(gè)轉(zhuǎn)錄本,T01和T02編碼相同的氨基酸,區(qū)別在于T01的5′端非翻譯區(qū)比 T02 多一段,T03編碼882個(gè)氨基酸,在N端比T01和T02少了63個(gè)氨基酸。在后續(xù)分析時(shí)將SiPPDK2同一基因位點(diǎn)出現(xiàn)的3個(gè)可變剪切體視為同一基因,僅以原始轉(zhuǎn)錄本對(duì)應(yīng)的序列作為該基因的分析對(duì)象。利用Cello軟件對(duì)谷子SiPPDK2蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了分析,結(jié)果預(yù)測(cè)其位于葉綠體中。

表1 SiPPDK2 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)Tab.1 Physicochemical property of SiPPDK2 protein

圖1 SiPPDK2的基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of SiPPDK2 gene

2.2 PPDK序列比對(duì)及親緣關(guān)系分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索了不同物種PPDK氨基酸同源序列,包括玉米ZmPPDK1、ZmPPDK2、ZmPPDK3,高粱SbPPDK1、SbPPDK2、SbPPDK3,水稻OsPPDK1、OsPPDK2、OsPPDK3,小麥TaPPDK,擬南芥AtPPDK1、AtPPDK2、AtPPDK3,火炬松PtPPDK1、PtPPDK2、PtPPDK3,苔蘚PpPPDK1、PpPPDK2、PpPPDK3。然后,對(duì)不同物種基因序列進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建了谷子SiPPDK2和其他物種PPDK蛋白成員的NJ進(jìn)化樹(shù)。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn),SiPPDK2與玉米、高粱、水稻、擬南芥同源性非常高,相似性分別為94.15%,93.33%,91.85%和89.41%,而與其他物種(小麥、火炬松、苔蘚)序列相似性則相對(duì)較低,分別僅為23.28%,9.72%和37.77%。

從圖3可以看出,所有PPDK蛋白被分為三大類群,其中,類群Ⅰ中包含擬南芥AtPPDK1、AtPPDK2、AtPPDK3和小麥TaPPDK；類群Ⅱ中包含谷子SiPPDK2,玉米ZmPPDK1、ZmPPDK2、ZmPPDK3,高粱SbPPDK1、SbPPDK2、SbPPDK3和水稻OsPPDK1、OsPPDK2、OsPPDK3；類群Ⅲ中包含裸子植物中的火炬松PtPPDK1、PtPPDK2、PtPPDK3和苔蘚PpPPDK1、PpPPDK2、PpPPDK3。在這些成員中,與谷子SiPPDK2的親緣關(guān)系較近的是高粱、玉米和水稻的PPDK蛋白,所以推測(cè)這些 PPDK蛋白具有類似的生物功能；SiPPDK2與小麥、苔蘚和火炬松的PPDK蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),表明這些成員的生物功能可能與谷子SiPPDK2差異較大。

圖中黑色背景氨基酸表示相同氨基酸殘基；灰色背景氨基酸表示相似氨基酸殘基(相似性≥60%)。The black background amino acids represent the same amino acid residues； The gray background amino acids represent similar amino acid residues (≥60% similarity).

每個(gè)位點(diǎn)氨基酸替代值在底部用0.5刻度值標(biāo)出。Amino acid substitution values of each site were labeled with a 0.5 scale value at the bottom.

2.3 SiPPDK2基因的表達(dá)分析

2.3.1 苗期在非生物逆境脅迫下的表達(dá)分析SiPPDK2基因苗期不同逆境脅迫下的表達(dá)分析(圖4)表明,SiPPDK2基因受不同逆境誘導(dǎo),在苗期受ABA、低溫、干旱和鹽脅迫條件下,不同時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。在低溫脅迫時(shí),該基因表達(dá)量受強(qiáng)烈誘導(dǎo),隨處理時(shí)間點(diǎn)增加,呈連續(xù)上升趨勢(shì),在24 h急劇上升達(dá)到最大,為對(duì)照的25.80倍,較對(duì)照差異達(dá)極顯著水平；20% PEG脅迫時(shí),該基因表達(dá)量在各處理時(shí)間點(diǎn)均極顯著下降；ABA脅迫條件下,表達(dá)量呈現(xiàn)下降-上升-下降的趨勢(shì),在1 h和24 h顯著或極顯著下調(diào)表達(dá),分別為對(duì)照的64%,52%,而3 h和6 h極顯著上調(diào)表達(dá),在6 h時(shí)表達(dá)量為對(duì)照的2.92倍；NaCl脅迫時(shí),僅在6 h表達(dá)量稍有上調(diào),為對(duì)照的1.37倍,但差異未達(dá)顯著水平,在1,3,12,24 h的表達(dá)量均下調(diào),分別為對(duì)照的41%,54%,99%,68%,其中1,3 h下調(diào)達(dá)極顯著水平。綜合表明,SiPPDK2參與了谷子苗期的非生物脅迫應(yīng)答。

小寫(xiě)字母表示處理較對(duì)照(0 h)在0.05水平上差異顯著；大寫(xiě)字母表示處理較對(duì)照(0 h)在0.01水平上差異顯著。圖5-6同。Lowercase letters indicate significant difference at the level of 0.05 between the treatment and the control (0 h) ;Capital letters indicate significant difference at the level of 0.01 between the treatment and the control (0 h) . The same as Fig.5-6.

2.3.2 不同生育期干旱脅迫及不同光照強(qiáng)度下的表達(dá)分析SiPPDK2基因在谷子不同生育期干旱條件下的表達(dá)情況(圖5)表明,正常條件下,SiPPDK2在抽穗期和灌漿期的表達(dá)量較拔節(jié)期均下調(diào),分別為拔節(jié)期的81%和94%；干旱條件下,在抽穗期和灌漿期的表達(dá)量較拔節(jié)期均有極顯著上調(diào),分別為拔節(jié)期的6.03，4.58倍。由此可知,SiPPDK2在谷子不同生育時(shí)期干旱脅迫下其表達(dá)量均有明顯增加,表明SiPPDK2基因參與了谷子不同生育時(shí)期對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。SiPPDK2基因在谷子不同生育期干旱和光照強(qiáng)度條件下的表達(dá)情況(圖6)表明,SiPPDK2在抽穗期和灌漿期干旱條件下的表達(dá)量較對(duì)照均有極顯著上調(diào),而拔節(jié)期較對(duì)照的表達(dá)量有所下降,為對(duì)照的86%,但差異未達(dá)顯著水平；不同光照強(qiáng)度下,SiPPDK2在拔節(jié)期、灌漿期中等光照(光照Ⅰ)及抽穗期的中等光照(光照Ⅰ)和弱光照(光照Ⅱ)下的表達(dá)量趨于一致,較正常光照均有所下降,而在拔節(jié)期和灌漿期弱光照(光照Ⅱ)下的表達(dá)量均極顯著上調(diào),其中拔節(jié)期為正常光照的1.79倍,灌漿期為正常光照的2.14倍。由此可知,光照的強(qiáng)弱對(duì)SiPPDK2基因的表達(dá)具有極顯著影響,表明SiPPDK2基因參與了對(duì)光照脅迫的響應(yīng)。

圖5 正常和干旱條件下 SiPPDK2 在不同生育期的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of SiPPDK2 under normal and drought conditions during different growth tages

圖6 干旱和光照條件下SiPPDK2的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of SiPPDK2 under light and drought conditions

為了進(jìn)一步揭示SiPPDK2可能的生物功能,用plantCARE 在線軟件對(duì)順式作用元件進(jìn)行了預(yù)測(cè),結(jié)果(表2)顯示,在SiPPDK2基因的啟動(dòng)子區(qū)域中包含了多個(gè)與逆境、激素和光應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件,逆境(干旱、低溫、防御和應(yīng)激反應(yīng))應(yīng)答元件有MBS、LTR和WUN-motif；植物激素類應(yīng)答元件有生長(zhǎng)素應(yīng)答元件TGA-element、茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif和TGACG-motif；光應(yīng)答元件有I-box、SP1、GATA-motif。這些元件都暗示,SiPPDK2基因很可能參與了相應(yīng)的信號(hào)途徑。

表2 PlantCARE 預(yù)測(cè) SiPPDK2啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件Tab.2 cis-acting regulatory elements in promoter of SiPPDK2 predicted by plant CARE

3 結(jié)論與討論

在自然界中,植物會(huì)遭受強(qiáng)光、極端溫度、鹽漬化、水分虧缺和大氣干旱等各種環(huán)境因子的脅迫,其中,水分虧缺是影響干旱區(qū)植物生長(zhǎng)發(fā)育和導(dǎo)致生理生化響應(yīng)的主要因子和限制植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素[35]。初步研究表明,PPDK在植物逆境脅迫反應(yīng)中具有重要作用[36-37]。本研究獲得的SiPPDK2位于谷子3號(hào)染色體21 259 472-21 273 920區(qū)域,含有18 個(gè)內(nèi)含子,具有3個(gè)轉(zhuǎn)錄本；具有磷酸烯醇式丙酮酸保守結(jié)構(gòu)域,表明SiPPDK1基因是谷子PPDK家族成員；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明,SiPPDK2蛋白與玉米、高粱、水稻有較近的親緣關(guān)系,所以這些 PPDK蛋白在逆境應(yīng)答或其他信號(hào)途徑中有著相似的功能；亞細(xì)胞定位分析表明,SiPPDK2基因被定位在細(xì)胞的葉綠體中,這是植物光合作用的關(guān)鍵位置,揭示了它在植物光合作用信號(hào)途徑中起比較重要的作用。

本研究中,SiPPDK2基因在苗期對(duì)ABA、低溫、干旱和鹽脅迫均有響應(yīng),除在20% PEG脅迫時(shí),SiPPDK2基因表達(dá)量在各處理時(shí)間點(diǎn)下調(diào)外,其他脅迫處理下都至少有1個(gè)時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)上調(diào),其中以低溫脅迫時(shí),在24 h表達(dá)量最大。進(jìn)一步試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),SiPPDK2基因在不同關(guān)鍵生育期干旱和光照脅迫下也有不同的響應(yīng)。干旱條件下,在抽穗期和灌漿期表達(dá)量較對(duì)照均有極顯著上調(diào),以抽穗期時(shí)表達(dá)量最高；不同光照強(qiáng)度下,在拔節(jié)期和灌漿期弱光下表達(dá)量上調(diào)極顯著。以上試驗(yàn)結(jié)果都表明,谷子SiPPDK2基因廣泛參與了植物非生物逆境脅迫應(yīng)答。前人也有相似的研究結(jié)果,脫落酸、聚乙二醇以及淹水顯著地增加了水稻根中PPKD基因的表達(dá)；在干旱、低溫、高鹽以及甘露醇等缺水脅迫下,苗期水稻同樣在根中誘導(dǎo)PPDK產(chǎn)生；在低氧脅迫(淹水培養(yǎng)或無(wú)氧環(huán)境培養(yǎng))條件下,水稻幼苗中、幼苗根和胚芽鞘都可以誘導(dǎo)PPDK合成[38]。高溫脅迫下,水稻籽粒中胞質(zhì)型PPDK的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)[39]。上述研究均說(shuō)明PPDK基因在植物逆境應(yīng)答中起一定作用。順式元件分析也表明,在SiPPDK2啟動(dòng)子區(qū)域含有ABA、低溫、干旱和防御應(yīng)激反應(yīng)等順式元件。

本研究從谷子全基因組中鑒定出1個(gè)PPDK基因家族成員,命名為SiPPDK2,其定位在谷子的3號(hào)染色體上,位于葉綠體,含有 18個(gè)內(nèi)含子,有3個(gè)轉(zhuǎn)錄本,具有磷酸烯醇式丙酮酸高度保守結(jié)構(gòu)域；SiPPDK2基因廣泛參與了谷子苗期非生物逆境脅迫應(yīng)答,在關(guān)鍵生育期光照和干旱逆境脅迫應(yīng)答中起重要作用,而其中的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。