許振山， 張 靜， 張偉麗， 梁俊平，， 李 健， 李吉濤

（1. 河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453007；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266071）

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)是一種小型經(jīng)濟(jì)蝦類，廣泛分布于中國(guó)沿海和朝鮮半島西岸的淺海水域，生長(zhǎng)速度快，適應(yīng)性廣[1-2]，特別是對(duì)鹽度具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，在河口及淺海區(qū)域均可正常生存，甚至通過逐漸淡化可在淡水中生存[3]。梁俊平等[4]研究發(fā)現(xiàn)，脊尾白蝦在5-30鹽度下，可正常抱卵、孵化，但在不同鹽度下，子代生長(zhǎng)速度差異顯著，其最適生長(zhǎng)鹽度為20，在此鹽度下Na+-K+-ATPase mRNA表達(dá)量也最低，可能是在此鹽度下，滲透壓調(diào)節(jié)耗能較小，更多的能量用于了生長(zhǎng)。研究表明，鹽度不僅會(huì)影響甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)、繁殖，而且會(huì)影響甲殼動(dòng)物免疫防御能力。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）從鹽度為25的水體中轉(zhuǎn)移到鹽度為5和15的水體中后，其酚氧化酶（phenofoxidase，PO）活力均有所下降，而轉(zhuǎn)移到35的水中，其PO活力顯著增加。葉建生等[6]研究也發(fā)現(xiàn)，鹽度突變對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫酶活有顯著影響，當(dāng)從鹽度30突變到27、24、21等不同鹽度后，超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）酶活力顯著降低。王瑞芳等[7]對(duì)中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）急性鹽度脅迫后發(fā)現(xiàn)，PO活力隨鹽度逐漸升高呈顯著下降趨勢(shì)。由此可見，急性鹽度變化對(duì)甲殼動(dòng)物免疫力有重要影響。

李玉全、李洋等[8-10]對(duì)脊尾白蝦急性鹽度脅迫后發(fā)現(xiàn)，無論是高鹽度突降到低鹽度或是低鹽度驟升到高鹽度，都會(huì)對(duì)SOD、PO活力產(chǎn)生負(fù)面影響。那么，對(duì)于長(zhǎng)期生活在不同鹽度水體中脊尾白蝦，其生長(zhǎng)速度與其免疫力是否存在某種相關(guān)性？本研究選擇長(zhǎng)期生活在不同鹽度下的脊尾白蝦，比較了不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺proPO和SOD基因表達(dá)及其酶活力水平，以期為不同鹽度水域脊尾白蝦健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

性成熟脊尾白蝦親蝦經(jīng)逐漸淡化后，養(yǎng)殖于鹽度30、25、20、15、10、5水體中，在此6個(gè)鹽度下交尾抱卵，直至幼體孵化，并繼續(xù)培育。本實(shí)驗(yàn)選取不同鹽度下生長(zhǎng)的幼蝦，養(yǎng)殖于200 LPVC桶，水溫18℃，充氣。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取樣及樣品處理

每個(gè)鹽度設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取5尾脊尾白蝦，迅速解剖取肝胰腺置入1.5 mL無RNA酶離心管，放入液氮冷凍。之后將肝胰腺放入研缽，加液氮研磨成粉末，一部分研磨樣品轉(zhuǎn)移至離心管，加入預(yù)冷PBS 緩沖溶液，漩渦震蕩，4℃800×g離心10 min，吸取上清液，置-80℃保存用于酶活力測(cè)定。取另一部分研磨樣品轉(zhuǎn)至1.5 mL無RNA酶離心管(內(nèi)含1.0 mL TRIzol液)，漩渦震蕩，置-80℃保存用于總RNA提取。

1.2.2 酶活力測(cè)定

采用試劑盒（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)）測(cè)定SOD活性，采用改進(jìn)的Ashida方法和雷質(zhì)文等[12]方法測(cè)定PO活性。

1.2.3 proPO基因和SOD基因表達(dá)分析

采用Trizol法提取脊尾白蝦肝胰腺RNA，用MOPS瓊脂糖電泳檢測(cè)總RNA的完整性，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。根據(jù)GenBank中脊尾白蝦proPO基因和SOD基因序列，分別設(shè)計(jì)熒光定量特異引物，內(nèi)參基因?yàn)閍ctin，所用引物如表1所示。利用熒光定量PCR對(duì)不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺proPO基因和SOD基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序按照SYBR Premix Ex TaqTM II(TaKaRa)試劑盒說明書進(jìn)行。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△CT法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

各鹽度下酶活力和基因表達(dá)量以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，采用SPSS16.0軟件中單因子方差分析(one-way-ANOVA)檢驗(yàn)顯著性差異(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺proPO基因表達(dá)量和PO活力變化

如圖1所示，隨著鹽度升高，脊尾白蝦肝胰腺proPO基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，鹽度15和20兩組間的proPO基因表達(dá)量無顯著性差異（P＞0.05），但顯著高于其它鹽度組的表達(dá)量（P＜0.05）。脊尾白蝦肝胰腺PO活力也呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，鹽度15 和20 兩組間的酶活力無顯著性差異（P＞0.05），但顯著高于其它鹽度組的酶活力（P＜0.05）（圖2）。

圖1 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺proPO基因表達(dá)量變化Fig.1 Effect of salinity on proPO mRNA levels of E. carinicauda

圖2 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺PO活力Fig.2 Effect of salinity on PO activities of E. carinicauda

2.2 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺SOD基因表達(dá)量和SOD活力變化

如圖3所示，隨著鹽度升高，脊尾白蝦肝胰腺SOD基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，鹽度15和20時(shí)的SOD基因表達(dá)量顯著高于其它鹽度組基因表達(dá)量（P＜0.05）；肝胰腺SOD活力變化趨勢(shì)與其基因表達(dá)趨勢(shì)相同（圖4）。

圖3 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺SOD基因表達(dá)量變化Fig.3 Effect of salinity on SOD mRNA levels of E. carinicauda

圖4 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺中SOD活力Fig.4 Effect of salinity on SOD activities of E. carinicauda

3 討論

3.1 不同鹽度下脊尾白蝦proPO基因表達(dá)量及PO活力變化

酚氧化酶（phenofoxidase，PO）在甲殼動(dòng)物的非特性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要識(shí)別和防御作用[13]。一般情況下，PO以無活性的酚氧化酶原(prophenoloxidase，proPO)形式存在，β-1，3-葡聚糖（β-1，3-G）、脂多糖、胰蛋白、加熱、Ca2+濃度下降等都可以激活proPO系統(tǒng)，引發(fā)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，生成有活性的PO[8]，對(duì)病原體起到抑制作用或殺死病原體，從而可降低微生物對(duì)宿主的感染幾率[8-14]。本研究顯示，長(zhǎng)期生活在不同鹽度水體中的脊尾白蝦，PO活力隨著鹽度升高均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，在鹽度15和20時(shí)的酶活力顯著高于其它鹽度組，同時(shí)proPO基因mRNA表達(dá)量也呈現(xiàn)相似趨勢(shì)。前期研究發(fā)現(xiàn)，脊尾白蝦在鹽度17.5左右表現(xiàn)出最快生長(zhǎng)速度[4]，與PO活力變化趨勢(shì)基本一致。這說明在此鹽度下，脊尾白蝦proPO系統(tǒng)可被有效激活，以提高自身免疫力應(yīng)對(duì)環(huán)境變化。

當(dāng)凡納濱對(duì)蝦從鹽度為25的水體中轉(zhuǎn)移到鹽度為5和15的水體中后，其PO活力均有所下降，而轉(zhuǎn)移到35的水中，其PO活力有所增加[5]，說明不適鹽度降低了凡納濱對(duì)蝦的免疫力。在中華絨螯蟹研究中也發(fā)現(xiàn)，與淡水組相比，隨著鹽度逐漸升高，中華絨螯蟹雄蟹PO活力呈顯著下降趨勢(shì)[15]。而當(dāng)凡納濱對(duì)蝦仔蝦養(yǎng)殖在鹽度2.5、5、15、25、35水體中24周后，鹽度15、25、35時(shí)PO活力顯著高于鹽度為2.5和5 的活力；通過溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和WSSV感染后發(fā)現(xiàn)，鹽度15、25、35時(shí)的死亡率顯著低于鹽度為2.5和5的死亡率，研究認(rèn)為凡納濱對(duì)蝦在低鹽度下抗病力降低與體內(nèi)PO活力降低有關(guān)[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致，說明PO酶活力可作為評(píng)價(jià)脊尾白蝦不同鹽度下免疫力強(qiáng)弱的指標(biāo)。李洋等[8]研究顯示，不同鹽度急性脅迫后，低鹽度下脊尾白蝦proPO基因表達(dá)量在短時(shí)間內(nèi)顯著高于高鹽度組，而當(dāng)脅迫48 h后，各鹽度下proPO基因表達(dá)量趨于穩(wěn)定且無顯著性差異，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有相似之處，但也有一定差別?？赡苁怯捎诓煌瑢?shí)驗(yàn)所選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生活環(huán)境不同所導(dǎo)致，李洋等[8]所選的脊尾白蝦為生活在鹽度32的成蝦，對(duì)鹽度適應(yīng)性較強(qiáng)，短時(shí)間內(nèi)對(duì)鹽度變化導(dǎo)致免疫酶活變化顯著，而后適應(yīng)了各鹽度條件。而本實(shí)驗(yàn)所選脊尾白蝦幼蝦為在各鹽度下孵化而來，從幼體階段一直生活在其各自鹽度環(huán)境條件下，其免疫酶活是各鹽度下長(zhǎng)期適應(yīng)下的反映。

3.2 不同鹽度下脊尾白蝦SOD基因表達(dá)量及其酶活力變化

SOD是機(jī)體內(nèi)重要的的抗氧化酶之一，可以阻斷因自由基造成的細(xì)胞損傷，并及時(shí)修復(fù)損傷細(xì)胞，在抗氧化方面發(fā)揮重要的生理作用[17]。在凡納濱對(duì)蝦成蝦中研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽度從30突變到27、24、21等低鹽度后，鹽度突變組SOD活性顯著低于對(duì)照組[6]。當(dāng)鹽度從12驟降到8或5時(shí)，凡納濱對(duì)蝦仔蝦SOD活性也顯著降低[18]。李玉全等[10]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽度從33降低到5或升高至45 時(shí)，都會(huì)對(duì)脊尾白蝦SOD活力產(chǎn)生負(fù)面影響，而對(duì)照組鹽度33時(shí)的SOD 活力維持在最高水平。由此可見，當(dāng)甲殼動(dòng)物處于最佳生活環(huán)境下，其免疫力也最強(qiáng)，而環(huán)境突變可能會(huì)顯著影響其免疫力。本研究顯示，長(zhǎng)期生活在不同鹽度水體中的脊尾白蝦，SOD活力隨著鹽度升高均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，在鹽度15和20時(shí)的酶活力顯著高于其它鹽度組，SOD基因mRNA表達(dá)量也呈現(xiàn)相似趨勢(shì)。梁俊平等[4]研究發(fā)現(xiàn)，脊尾白蝦在鹽度17.5左右表現(xiàn)出最快生長(zhǎng)速度；姜巨峰等[19]也發(fā)現(xiàn)，脊尾白蝦在鹽度15、20時(shí)的特定生長(zhǎng)率顯著高于其它鹽度組。說明脊尾白蝦在鹽度15-20時(shí)表現(xiàn)出最快生長(zhǎng)速度與其具有較強(qiáng)免疫力密切相關(guān)。