王曉玲，沈麗賢，李惠文，張亞芹，李 瑤，吳書娜

(河北中醫(yī)肝病醫(yī)院 二病區(qū)，河北 石家莊 050800)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，全球約有3.5億慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者，大大增加了肝硬化和肝癌的發(fā)生概率。人體的免疫反應(yīng)與HBV的相互作用對(duì)宿主的臨床結(jié)局起著決定性作用，病毒清除需要輔助性T細(xì)胞(T helper,Th)和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)的激活，發(fā)揮有效作用。有學(xué)者認(rèn)為，HBV-特異性T細(xì)胞的功能缺陷讓HBV感染慢性化[1]，其功能缺陷的原因仍不是很清楚。作為重要的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APC)，樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)能有效激活T細(xì)胞反應(yīng)，對(duì)臨床結(jié)局起重要作用，尤其是HBV感染初期[2-4]。DC分為髓樣DC(mDC)和漿細(xì)胞樣DC(pDC)：mDC主要發(fā)揮抗原提呈作用；pDC則可以產(chǎn)生大量Ⅰ型干擾素(interferon-Ⅰ,IFN-Ⅰ)，協(xié)助激活固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，在抗HBV免疫反應(yīng)中起著中樞性的作用[5-7]。外周血pDCs在慢性乙型肝炎(chornic hepatitis B,CHB)患者中雖然數(shù)量沒有改變，但表型和功能均有受損[8]。有關(guān)pDCs在急性乙型肝炎(acute hepatitis B,AHB)患者中的變化及作用研究較少，其具體作用機(jī)制尚不清楚。DC 細(xì)胞在外周血淋巴細(xì)胞中所占的比例很小，其發(fā)揮免疫作用主要是通過分泌Ⅰ型干擾素或細(xì)胞因子，DC 在適應(yīng)性免疫過程中作為抗原提呈細(xì)胞，活化 T淋巴細(xì)胞參與抗病毒過程。DC與NK細(xì)胞之間還同時(shí)存在相互作用[9]，即NK細(xì)胞調(diào)節(jié) DC的分化方向，DC分泌細(xì)胞因子促進(jìn)NK細(xì)胞活化。本研究納入AHB患者40例，采用酶聯(lián)免疫方法及細(xì)胞流式技術(shù)進(jìn)行研究，旨在探討pDCs在AHB患者臨床轉(zhuǎn)歸中的變化及作用，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 2015年6月-2017年5月于醫(yī)院就診的急性乙型肝炎(AHB)患者40例，男12例，女28例，年齡21～71歲，平均(59.5±7.1)歲。①診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考《病毒性肝炎防治方案》[7]，患者感染HBV前(>6月)無乙型肝炎病史，感染后出現(xiàn)AHB臨床癥狀，HBsAg陽(yáng)性、HBV-DNA陽(yáng)性、HBc-IgM陽(yáng)性、肝功能異常。②納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡18～75歲，性別不限，診斷符合AHB診斷標(biāo)準(zhǔn)，首次確診病例，未接受過抗病毒藥物治療及免疫治療，患者依從性好，能完成相關(guān)檢查。③排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡<18歲或>75歲，合并其他病毒性肝炎，HIV感染，藥物性、酒精性及自身免疫性肝炎，合并其他系統(tǒng)器官嚴(yán)重疾病，合并腫瘤、免疫相關(guān)疾病等，合并精神疾病或癲癇，妊娠期或哺乳期女性，依從性差，不能完成全部檢查項(xiàng)目。另納入基線資料匹配的同期健康體檢者26例為健康對(duì)照組(health control,HC)，其中男6例，女20例，年齡24～71歲，平均(55.2±6.3)歲。2組受試者性別、年齡等基本臨床資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，全部受試者均知情同意并簽署知情書。

1.2治療方法 AHB患者入院確診后均囑其充分休息、合理飲食、適當(dāng)增加營(yíng)養(yǎng)，并根據(jù)病情給予退黃、降酶、保肝等對(duì)癥治療，改善肝臟微循環(huán)，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素治療，部分患者給予人血白蛋白注射液等對(duì)癥支持處理，預(yù)防患者病情重癥化或慢性化，綜合病情給予核苷類似物，全部患者應(yīng)用恩替卡韋分散片(江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))0.5 mg空腹口服，1次/d。

1.3檢測(cè)指標(biāo)與方法 健康體檢者在體檢當(dāng)日清晨、AHB患者在住院次日及治療6周后清晨空腹抽取靜脈血5 ml,應(yīng)用貝克曼庫(kù)爾特離心機(jī)以2 000 r/min離心5 min，取上清液，置于-70 ℃冰箱保存待測(cè)，由檢驗(yàn)科醫(yī)師按試劑盒操作說明書進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.1HBV DNA、HBsAg、HBeAg及肝功能檢測(cè) 取血液標(biāo)本2 ml，HBV DNA定量檢測(cè)采用熒光定量PCR法，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，試劑盒購(gòu)自湖南圣湘生物科技有限公司。HBsAg、HbeAg等乙型肝炎標(biāo)志物采用電化學(xué)發(fā)光法(ECL)進(jìn)行定量檢測(cè)，HBsAg正常參考值0～0.08 IU/ml,HbeAg正常參考值0～1 S/CO，試劑盒購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，應(yīng)用Elec-sys2010電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)。并根據(jù)治療前后檢測(cè)結(jié)果計(jì)算HBV DNA轉(zhuǎn)陰率、HBsAg清除率、HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率。

1.3.2外周血pDCs檢測(cè) 取血樣標(biāo)本200 μl分別加入Lin1-FITC 3 μl，HLA-DR-PerCP 3 μl，CD123-APC 3 μl，CD86-PE 5 μl，室溫避光染色，加入紅細(xì)胞裂解液，應(yīng)用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，參照試劑盒說明書加入熒光標(biāo)記的相應(yīng)抗體(均購(gòu)自美國(guó)RD公司)，避光結(jié)合30 min后，置于冰上待檢。使用MDL-Flow流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn))完成檢測(cè)，利用微球定量，根據(jù)流式細(xì)胞儀測(cè)定時(shí)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出pDCs表面CD86分子的絕對(duì)計(jì)數(shù)(CD86ABC)。全部過程嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1AHB患者治療前后肝功能指標(biāo)比較 治療6周后，AHB患者肝功能指標(biāo)明顯改善，與治療前比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01),見表1。

表1 AHB患者治療前后肝功能指標(biāo)比較

2.2AHB患者治療前后乙型肝炎標(biāo)志物水平比較 治療6周后，AHB患者乙型肝炎標(biāo)志物水平明顯下降，與治療前比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表2。

表2 AHB患者治療前后乙型肝炎標(biāo)志物水平比較

2.3HBV DNA轉(zhuǎn)陰率、HBsAg清除率、HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率變化 治療6周后，AHB患者HBV DNA轉(zhuǎn)陰率為82.5%，HBsAg清除率為72.5%，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為75.0%，與治療前比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表3。

2.4外周血pDCs頻數(shù)比較 治療前HC組與AHB組外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而AHB組治療后PBMC頻數(shù)顯著低于治療前。HC組外周血pDCs頻數(shù)顯著高于AHB組治療前，而AHB組治療后與治療前pDCs頻數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

表3 AHB患者治療后HBV DNA轉(zhuǎn)陰率、HBsAg清除率、HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率比較[例(%)]

2.5CD86+pDCs頻數(shù)比較 治療前HC組與AHB組CD86+pDCs頻數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AHB組治療后CD86+pDCs頻數(shù)顯著高于治療前。HC組CD86ABC顯著低于AHB組治療前，而AHB組治療后與治療前CD86ABC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

3 討 論

急性乙型肝炎多數(shù)呈自限性過程，預(yù)后一般良好，臨床上一般無需抗病毒治療，但仍有 5%～10%的患者會(huì)發(fā)展為慢性乙型肝炎，導(dǎo)致病情遷延，影響患者預(yù)后。因此對(duì)可能會(huì)演變?yōu)槁砸倚透窝椎腁HB患者應(yīng)及時(shí)進(jìn)行抗病毒及免疫調(diào)節(jié)治療，以減少其轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝譡10-11]。另有研究表明，對(duì)于少數(shù)急性乙型肝炎患者，經(jīng)相應(yīng)治療后肝功能正?；蚧菊＃琀BV DNA或HBsAg滴度降低，或者行肝組織病理檢查發(fā)現(xiàn)病變時(shí)，還應(yīng)積極進(jìn)行干擾素或胸腺肽治療，以清除病毒，加快乙型肝炎標(biāo)志物的血清學(xué)轉(zhuǎn)換[12-13]。本研究中，AHB患者治療6周后 HBV DNA轉(zhuǎn)陰率為82.5%，HBsAg清除率為72.5%，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為75.0%，均取得了較好的療效。

在慢性HBV感染患者，免疫控制對(duì)病毒的清除至關(guān)重要，但HBV也進(jìn)化出了相應(yīng)的機(jī)制去逃避免疫系統(tǒng)的清除。HBV雖然激活了人體的免疫系統(tǒng)，但可以逃避甚至破壞人體免疫系統(tǒng)，具體機(jī)制尚不十分明確。受多種因素影響，不同HBV感染者的臨床結(jié)局往往不同[14-15]。在眾多參與抗HBV免疫反應(yīng)細(xì)胞里，pDCs發(fā)揮著中樞性的作用。pDCs可以通過TLRs(Toll like receptors)直接識(shí)別HBV的核酸、單鏈RNA以及未甲基化的DNA。TLRs(TLR7和TLR9)一經(jīng)觸發(fā)，pDCs不但能快速、大量的產(chǎn)生IFN-Ⅰ，而且可以產(chǎn)生其他的細(xì)胞因子如TNF-α(tumor necrosis factor)、IL-6(interleukin)以及細(xì)胞表面共刺激分子[16-17]。這些細(xì)胞因子即可以直接抑制HBV的復(fù)制，而且還可以激活自然殺傷(NK)細(xì)胞及T細(xì)胞，激活和調(diào)控抗病毒免疫，間接發(fā)揮清除HBV的作用。另外，pDCs還可以直接從被感染的細(xì)胞中識(shí)別和提成HBV抗原[18-19]。

國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)基礎(chǔ)研究對(duì)DC在乙型肝炎動(dòng)物模型中的作用及可能機(jī)制進(jìn)行了分析探討，但目前臨床應(yīng)用還較少，這是由于此類治療方法尚不能達(dá)到預(yù)期的清除病毒療效，還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，IL-18具有刺激Thl細(xì)胞分泌產(chǎn)生IFN-1及IL-2的功能，進(jìn)而提高患者細(xì)胞免疫功能，因此可能具有增強(qiáng)DC治療乙型肝炎療效的作用，但目前僅為臨床前期研究[20-21]，進(jìn)一步相關(guān)機(jī)制及具體療效尚需后期開展大規(guī)模臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。

在慢性HBV感染患者，外周血pDCs數(shù)量沒有變化，似乎不受HBV影響，但發(fā)現(xiàn)其功能包括分泌IFN-α的能力受損[22]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，HBV攜帶者mDC和pDCs的頻數(shù)和功能無論在體內(nèi)還是體外均未改變。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，HBV不直接影響pDCs。我們的研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照相比，在急性乙型肝炎患者pDCs的頻數(shù)降低，且在治療后第6周無明顯變化。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能為pDCs在慢性HBV感染患者被抑制，并沒有發(fā)揮相應(yīng)的作用，數(shù)量未出現(xiàn)明顯改變。而在急性乙型肝炎患者外周血pDCs發(fā)揮重要作用，大量pDCs被招募到肝臟參與炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)歸巢現(xiàn)象[23]，導(dǎo)致外周血pDCs下降，且在治療后一定時(shí)間內(nèi)仍在肝臟聚集。pDCs表面的共刺激分子CD86與T細(xì)胞表面的CD28結(jié)合后可協(xié)同刺激T細(xì)胞活化，有助于HBV的清除[24]。相對(duì)于非活動(dòng)HBsAg攜帶者，慢性HBV感染免疫耐受期患者pDCs表面CD86+表達(dá)顯著下調(diào)[25]，間接說明HBV感染的慢性化的原因可能為pDCs功能受損導(dǎo)致。DC的免疫功能取決于其免疫狀態(tài)，其表面CD83、CD86等免疫分子的表達(dá)水平低下或缺失將導(dǎo)致DC免疫功能低下或無免疫作用。乙型肝炎病毒及其蛋白可抑制pDC功能，經(jīng)抗病毒治療后，雖然DC細(xì)胞絕對(duì)數(shù)(CD86ABC)無顯著變化，但具有刺激功能的CD86+pDC頻數(shù)顯著增加，表明pDC功能有所恢復(fù)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)急性乙型肝炎患者發(fā)病初期pDCs表面CD86+的表達(dá)上調(diào)，且在治療后仍持續(xù)高水平表達(dá)。而在治療過程中CD86+pDCs的數(shù)量明顯增加，提示CD86+pDCs可能在清除HBV過程中發(fā)揮重要作用。

總之，pDCs發(fā)揮有效的抗病毒作用是清除HBV的關(guān)鍵，而急性乙型肝炎與慢性乙型肝炎患者pDCs功能不同的原因，亦或說是pDCs的功能的不同決定了HBV感染的急性清除或慢性攜帶，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。