舒 莉，巨嘯晨，柴 浩，楊德勇，孫榮鑫

(新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)一科，新疆 烏魯木齊 830002)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是常見于兒童和青少年的原發(fā)性骨腫瘤，其惡性程度高、局部破壞性強(qiáng)，集中發(fā)生于股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端及脛骨遠(yuǎn)端，且其遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移能力極強(qiáng)[1]，早期診斷常見肺轉(zhuǎn)移，5年生存率僅為70%[2]。近年來隨著新輔助化療和手術(shù)治療技術(shù)的發(fā)展，OS患者的生存率有所提高，但其高復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率仍造成預(yù)后不良，與此同時腫瘤靶向基因治療顯示出良好的臨床應(yīng)用前景，因此，尋找新的OS基因治療靶點逐漸成為近年來研究的熱點。研究表明，OS組織中差異表達(dá)的微小RNA(microRNA，miR)-30c與OS患者總生存期顯著相關(guān)[3-4]，但其可能的生物學(xué)功能及作用機(jī)制尚不明確。本研究通過建立過表達(dá)miR-30c OS細(xì)胞模型，初步探究miR-30c在體內(nèi)外對OS細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1材料 成人OS細(xì)胞系U2OS、Saos2、Mg63、HuO9、KIKU、143B，hFOB1.19正常成骨細(xì)胞株均購自中科院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物研究所；PBS、胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購自美國Abmole公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；miR-30c mimic及無意義小分子陰性對照片段由美國Abcam公司設(shè)計合成；PCR檢測引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計合成，引物序列見表1。

1.2Real-time PCR檢測OS細(xì)胞系中miR-30c表達(dá)檢測 常規(guī)操作培養(yǎng)6種人OS細(xì)胞系及正常成骨細(xì)胞系至對數(shù)生長期，取適量細(xì)胞參照TRIzol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNAs，以U6作為內(nèi)參基因，使用qRT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μL，預(yù)設(shè)反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，設(shè)置40個循環(huán)；擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s做溶解曲線。采用2-△△Ct相對定量分析方法檢測細(xì)胞中miR-30c的表達(dá)水平。實驗過程中每種細(xì)胞樣品配置4個副孔，同時做陰性對照排除反應(yīng)體系中PCR污染及引物二聚體干擾。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3U2OS細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 成人OS細(xì)胞株U2OS用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，2～3 d 1∶3傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化以1×105/孔的密度接種于24孔板內(nèi)，待細(xì)胞密度長至70%～80%后，分為空白組、對照組及miR-30c過表達(dá)組，空白組不作任何處理，對照組與miR-30c過表達(dá)組分別轉(zhuǎn)染miRNA無序陰性對照物及miR-30c mimic至細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作嚴(yán)格參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞并進(jìn)行后續(xù)研究。

1.4克隆形成實驗 取轉(zhuǎn)染48 h后處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化并吹打成單個細(xì)胞，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基重懸備用。分別將3組細(xì)胞懸液接種到預(yù)熱含10 mL培養(yǎng)基的100 mm培養(yǎng)皿中，每組設(shè)置5個平行對照，輕輕搖動分散細(xì)胞，于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2～3周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時終止培養(yǎng)，棄上清，用PBS潤洗2～3次，加入5 mL 1∶3醋酸/甲醇固定細(xì)胞5 min，移除固定液，加入適量Giemsa染色液室溫避光染色30 min，染色結(jié)束后用PBS反復(fù)緩慢沖洗培養(yǎng)皿，空氣干燥后記錄克隆形成率。

1.5CCK-8檢測細(xì)胞體外增殖活力 參照CCK-8試劑盒說明書操作，收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞消化以5×103個/孔的密度接種至96孔板中，于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，分別于接種后24，48，72，96，120 h每孔加入10 μL CCK-8溶液混勻，注意避免產(chǎn)生氣泡，將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測每孔在450 nm處的吸光值。每組5個副孔，取平均值。

1.6細(xì)胞凋亡檢測 消化重懸轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，取5×104個細(xì)胞，1 000 g離心5 min，參照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒說明書，加入195 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，按比例加入Annexin V-FITC和PI染色處理后上流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測，Modfit軟件(美國Bio-Rad公司)分析各組細(xì)胞細(xì)胞周期分布。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果由4個象限組成，左下象限代表正常細(xì)胞[An(-)/PI(-)]，右下代表早期凋亡細(xì)胞[An(+)/PI(-)]，右上代表晚期凋亡和壞死細(xì)胞[An(+)/PI(+)]，左上代表破損細(xì)胞[An(-)/PI(+)]，統(tǒng)計早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例記為細(xì)胞凋亡率。

1.7Transwell體外遷移和侵襲實驗 消化收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用無血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌2次后重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個/mL，取500 μL細(xì)胞懸液加入至Transwell小室內(nèi)，向外室即24孔板內(nèi)加入600 μL完全培養(yǎng)基至浸沒小室下層，以提供細(xì)胞遷移運動趨化因子。常規(guī)培養(yǎng)36 h后棄去上下層培養(yǎng)基，PBS潤洗3次，向下室中加入600 μL預(yù)冷的75%乙醇室溫固定細(xì)胞30 min，吸出酒精至小室自然風(fēng)干，加入600 μL 0.1%結(jié)晶紫常溫避光染色15 min，清水沖洗小室3次，用棉簽擦拭內(nèi)室細(xì)胞及殘留染料。室溫晾干后顯微鏡下觀察穿過微孔至濾膜反面的細(xì)胞，每個小室隨機(jī)選取5個視野，每組設(shè)置4個平行副孔，拍照計數(shù)取平均值，比較轉(zhuǎn)染后細(xì)胞體外遷移能力的變化。

細(xì)胞體外侵襲實驗前1 d將10 g/L Matrigel膠用無血清的DMEM培養(yǎng)基1∶3稀釋，混勻后取20 μL稀釋后的Matrigel膠均勻鋪在Transwell小室濾膜上，于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱包被過夜，后續(xù)操作與細(xì)胞遷移實驗一致。

1.8裸鼠體內(nèi)成瘤實驗 無特定病原體(specific pathogens free，SPF)級雌性裸鼠，4～5周齡，體重(17.83±1.64)g，隨機(jī)分為3組，每組7只，購自常州卡文斯實驗動物有限公司。消化收集轉(zhuǎn)染后長至對數(shù)生長期的細(xì)胞離心并調(diào)整細(xì)胞濃度至2×107個/mL，PBS清洗1次后用1 mL生理鹽水重懸細(xì)胞。75%乙醇清潔消毒裸鼠皮膚后用1 mL一次性注射器將收集的細(xì)胞懸液按每只裸鼠0.1 mL體積注入小鼠左腋皮下，穿刺點距離注射部位1 cm。SPF環(huán)境飼養(yǎng)接瘤后的裸鼠，定期觀察裸鼠一般活動狀況及皮下腫瘤形成情況，每周測量腫瘤大小，記錄腫瘤塊最大直徑(a)、最小直徑(b)，并計算腫瘤體積，計算公式為V(cm2)=ab2/2，繪制腫瘤生長曲線圖。4周后脫頸處死裸鼠，剝除腫瘤并拍照，測量并記錄裸鼠移植瘤瘤重。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用單因素方差分析、SNK-q檢驗和重復(fù)測量的方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1miR-30c低表達(dá)于多種OS細(xì)胞系 通過qRT-PCR對正常成骨細(xì)胞hFOB1.19及U2OS、Saos2、Mg63、HuO9、KIKU、143B等6種OS細(xì)胞中miR-30c的表達(dá)情況進(jìn)行倍數(shù)變化歸一化分析。結(jié)果表明，6種OS細(xì)胞系中miR-30c表達(dá)水平均明顯低于hFOB1.19細(xì)胞，其中U2OS細(xì)胞中miR-30c表達(dá)水平最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。因此，選擇U2OS作為候選細(xì)胞系開展后續(xù)研究。

表2 miR-30c在OS細(xì)胞系中相較于正常成骨細(xì)胞的表達(dá)比較Table 2 The expression of miR-30c in six OS cell lines compared with normal osteoblast cells

*P值<0.05與hFOB1.19比較(SNK-q檢驗)

2.2miR-30c抑制U2OS細(xì)胞體外克隆形成 通過平板克隆形成實驗檢測miR-30c對U2OS細(xì)胞單細(xì)胞干性及克隆形成能力的影響。空白組與對照組克隆形成數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明miR-30c mimic無意義對照物不對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。miR-30c過表達(dá)組克隆數(shù)目明顯少于對照組和空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明miR-30c抑制U2OS細(xì)胞體外干性及克隆形成能力。見圖1，表3。

圖1 miR-30c對U2OS細(xì)胞體外克隆形成的影響
A.空白組；B.對照租；C.miR-30c過表達(dá)組
Figure1EffectofmiR-30concolonyformationofU2OScellsinvitro

表3 各組細(xì)胞克隆形成數(shù)目比較Table 3 Comparison of the number of cell clones in each group 個)

*P值<0.05與空白組比較 #P值<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

2.3miR-30c抑制U2OS細(xì)胞增殖 CCK-8法檢測鋪板24，48，72，96，120 h各組細(xì)胞增殖情況。隨時間延長，各組細(xì)胞增殖能力呈升高趨勢，但miR-30c過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力明顯低于空白組和對照組，組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

2.4miR-30c促進(jìn)U2OS細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-30c對U2OS細(xì)胞凋亡的影響。過表達(dá)miR-30c組U2OS細(xì)胞凋亡率明顯高于空白組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表4 各組細(xì)胞增殖能力比較Table 4 Comparison of cell proliferation in each group

表5 各組細(xì)胞凋亡率比較Table 5 Comparison of apoptosis rate in each group

*P值<0.05與空白組比較 #P值<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

2.5miR-30c抑制U2OS細(xì)胞體外侵襲和遷移 在體外培養(yǎng)36 h后，miR-30c過表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30c mimic后侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于空白組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表6。

2.6miR-30c抑制U2OS細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力 跟蹤觀察并記錄接瘤4周內(nèi)裸鼠皮下移植瘤體積變化趨勢及剖瘤后瘤體積及瘤重間差異，以衡量miR-30c在體內(nèi)對U2OS細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，裸鼠皮下接瘤4周后，miR-30c過表達(dá)組小鼠體內(nèi)移植瘤體積和重量明顯小于空白組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明過表達(dá)miR-30c可以抑制U2OS細(xì)胞皮下成瘤能力。見表7。

圖2 miR-30c對細(xì)胞體外遷移侵襲的影響
A.空白組侵襲細(xì)胞;B.對照組侵襲細(xì)胞;C.miR-30c過表達(dá)組侵襲細(xì)胞;D.空白組遷移細(xì)胞;E.對照組遷移細(xì)胞;F.miR-30c過表達(dá)組遷移細(xì)胞
Figure2EffectsofmicroRNA-30concellmigrationandinvasioninvitro

表6 各組細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)量比較Table 6 Comparison of cell migration and invasion in each group 個)

*P值<0.05與空白組比較 #P值<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

表7 各組細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響Table 7 The effect of tumor formation ability in each group

*P值<0.05與空白組比較 #P值<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

微小核糖核酸(micro ribonucleic acids,miRNAs)是在動植物基因組中均廣泛存在的一類由20～24個核苷酸組成的內(nèi)源新高度保守的非編碼RNA。研究表明miRNAs參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、代謝和凋亡等多種正常生理功能，其在生物體內(nèi)的異常表達(dá)導(dǎo)致多種疾病及腫瘤的發(fā)生[5-6]。近年來，研究者已從OS中篩選出一些異常表達(dá)的miRNAs，例如miR-34可通過抑制Notch信號途徑抑制成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)OS發(fā)生[7]；miR-16可靶向抑制絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK)信號通路，沉默胰島素樣生長因子1受體(Insulin like growth factor 1 receptor, IGF1R)表達(dá)，抑制成骨細(xì)胞生長[8]。另一方面，miR-30c作為miR-30家族的重要成員之一，在多種腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲過程中發(fā)揮著重要作用[9]，而其在OS中可能發(fā)揮的生物學(xué)功能及作用機(jī)制尚不明確，因此本研究旨在通過驗證miR-30c在OS中可能發(fā)揮的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步揭示OS的發(fā)病機(jī)制及其靶向治療提供新的依據(jù)。

通過對OS及其相關(guān)細(xì)胞系全基因組表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)miR-30c表達(dá)普遍下調(diào)，但仍存有相反的報道[10-11]。因此本研究基于對U2OS、Saos2、Mg63、HuO9、KIKU、143B 6種OS細(xì)胞系及人正常成骨細(xì)胞hFOB1.19中miR-30c的表達(dá)進(jìn)行定量PCR分析，結(jié)果表明miR-30c在6種OS細(xì)胞系中的表達(dá)均明顯低于hFOB1.19細(xì)胞，顯示出低表達(dá)趨勢，且U2OS細(xì)胞中miR-30c最低，因此選取U2OS作為后續(xù)功能研究的目的細(xì)胞系。通過構(gòu)建U2OS細(xì)胞miR-30c過表達(dá)細(xì)胞系進(jìn)一步驗證miR-30c在U2OS細(xì)胞中的作用。結(jié)果顯示，在克隆形成和CCK-8實驗中，過表達(dá)miR-30c顯著抑制U2OS細(xì)胞體外增殖及克隆形成能力，提示miR-30c可能通過作為抑癌基因參與OS的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示過表達(dá)miR-30c能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，miR-30c可能通過誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞程序性死亡發(fā)揮抑癌作用。細(xì)胞遷移及侵襲實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-30c顯著抑制U2OS細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移，考慮到OS早期易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的特性，提示miR-30c可能通過抑制OS細(xì)胞轉(zhuǎn)移從而抑制OS的發(fā)展，進(jìn)一步發(fā)揮抑癌作用。另一方面，由于體內(nèi)外有著諸多不同的差異且生物體內(nèi)具有復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)，通過構(gòu)建裸鼠移植瘤模型驗證miR-30c是否能在生物體內(nèi)發(fā)揮相似的生物學(xué)作用，結(jié)果顯示，接瘤4周后miR-30c過表達(dá)組小鼠體內(nèi)移植瘤體積和重量明顯小于空白組和對照組(P<0.05)，提示miR-30c在體內(nèi)可能通過抑制腫瘤發(fā)生及OS細(xì)胞增殖發(fā)揮一定程度的抑癌作用。

參考以往文獻(xiàn)報道，miRNA在OS發(fā)病進(jìn)程中的作用機(jī)制常分為抑癌基因和致癌基因[12]，其中以miR-300、miR-301a、miR-20a為代表發(fā)揮典型促進(jìn)OS細(xì)胞系增殖及細(xì)胞周期進(jìn)程[13-14]，同時，miR-138、miR-497、miR-218等在OS早期診斷和預(yù)后中可發(fā)揮重要抑癌作用[15-16]，并與腫瘤分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。與這些miRNA作用相似的，本研究初步論證了miR-30c在OS U2OS細(xì)胞系可作為抑癌基因發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，為標(biāo)識OS的發(fā)生提供了新的參考依據(jù)，但作為龐大信號分子中的一員，miR-30c在U2OS細(xì)胞中進(jìn)一步的作用機(jī)制仍有待闡明，接下來將進(jìn)一步探究miR-30c及其下游信號分子調(diào)節(jié)機(jī)制，為后期實現(xiàn)OS的靶向治療提供新的依據(jù)。

總之，miR-30c有望成為OS腫瘤基因治療的潛在高效靶點。