高偉年，趙曙光，郭 娜，陳子英*，張文立，于 丁

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心臟大血管外科，河北 石家莊 050000；2.河北省石家莊市中醫(yī)院心病一科，河北 石家莊 050051)

心血管疾病已經(jīng)成為威脅人類健康最主要的因素。心血管疾病死亡占全球致死因素的1/3[1]。因此，研究心血管疾病的發(fā)病機制和治療策略尤為重要。心肌肥厚是多種心血管疾病共有的發(fā)病基礎(chǔ)[2]。因此，研究心肌肥厚的生物學(xué)過程和機制有助于研發(fā)治療心力衰竭等重大心血管疾病的治療策略。包含HECT和RLD結(jié)構(gòu)域的E3連接酶2(HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2，HERC2)是一種E3泛素連接酶。HERC2協(xié)調(diào)受損染色體上脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)修復(fù)因子的泛素依賴性組裝。HERC2穿梭于細胞核和細胞質(zhì)之間，它的C端HECT結(jié)構(gòu)域與乳腺癌易感基因1號(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)中的N端相互作用，誘導(dǎo)BRCA1的程序性降解。在本研究主要探討了E3泛素連接酶HERC2在心肌肥厚中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料 心肌組織收集于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心臟大血管外科，肥厚心肌組織取自主動脈瓣狹窄患者，對照組心肌組織收集取自房間隔缺損患者。本研究臨床樣本采集與大鼠動物實驗均通過了河北醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審批。所有患者均單獨簽署了知情同意書。所有實驗步驟均按照規(guī)定章程進行。SD大鼠及乳鼠購自北京維通利華生物科技有限公司。細胞改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清、抗生素購自ThermoFisher公司。siRNA及細胞轉(zhuǎn)染試劑RNAiMAX購自Invitrogen公司。細胞裂解液RIPA試劑購自碧云天生物科技有限公司。核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)提取相關(guān)試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ)購自Sigma公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、HERC2、磷脂肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、p-PI3K、AKT絲氨酸-蘇氨酸激酶(AKT serine/threonine kinase，AKT)、p-AKT抗體購自Abcam公司。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)偶聯(lián)二抗購自中杉金橋公司。電致化學(xué)發(fā)光液(electrogenerated chemiluminescence，ECL)購自碧云天生物科技有限公司。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer, PBS)購自Gibco公司。緩釋泵購自ALZET公司。

1.2方法

1.2.1大鼠心肌肥厚模型 成年SD大鼠經(jīng)氣體麻醉后，在其背部用手術(shù)剪刀剪開一個小口，在皮下植入緩釋泵，緩釋Ang Ⅱ，緩釋劑量為1.5 mg·kg-1·d-1，實驗周期為4周。

1.2.2大鼠原代心肌細胞分選與培養(yǎng) 用1～3 d SD乳鼠取心肌細胞。SD乳鼠經(jīng)酒精消毒后剪開胸腔，取出心室組織用預(yù)冷PBS洗凈，然后將心室組織剪碎至乳糜狀，加入胰酶消化至單細胞懸液，加入等體積含血清的培養(yǎng)基終止消化。隨后，1 500 r/min離心5 min去上清后將細胞用培養(yǎng)基重懸后，在細胞培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)2 h。此時，成纖維細胞已經(jīng)貼壁，可以將上清中心肌細胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)待用。培養(yǎng)條件為DMEM加入10%胎牛血清，1%抗生素，37 ℃培養(yǎng)。

1.2.3siRNA介導(dǎo)基因沉默 將對照siRNA和siHERC2(5′-GAGCTTTGCGTGGTCATCTT-GTTCT-3′)轉(zhuǎn)染進心肌細胞，沉默心肌細胞中HERC2表達。轉(zhuǎn)染用RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑盒進行，轉(zhuǎn)染方法按照說明書推薦比例進行轉(zhuǎn)染。

1.2.4心肌細胞肥大模型 新分選的細胞培養(yǎng)48 h后，換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，隨后用Ang Ⅱ (1 μmol/L)刺激48 h誘導(dǎo)心肌細胞肥大。

1.3Western blot 將新鮮組織或心肌細胞用放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液裂解后加入上樣緩沖液。取30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳，隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PDVF)膜上，將膜用洗膜緩沖液(tris buffered saline twee，TBST)洗2遍后，5%脫脂牛奶室溫封閉抗原1 h。用TBST洗 2遍膜，一抗4 ℃孵育過夜。第2天，取出膜后用TBST將其洗2遍，二抗室溫孵育2 h。隨后用TBST洗凈膜，用電致化學(xué)發(fā)光(electrogenerated chemiluminescence，ECL)顯影分析蛋白表達水平。

1.4qRT-PCR 將心肌組織或心肌細胞裂解后，用氯仿-異丙醇法提取新鮮組織總RNA。隨后用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對1 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。最后用qRT-PCR試劑盒分析目的基因表達水平。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primer

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 8統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用獨立樣本的t檢驗、單因素方差分析和Turkey檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HERC2在心肌肥厚患者中表達增加 結(jié)果顯示，心肌肥厚肥厚標志基因心房利鈉肽(natriuretic peptide A，ANP)(t=13.120,P<0.01)、腦鈉肽(natriuretic peptide B，BNP)、肌球蛋白重鏈7(myosin heavy chain 7，MYH7)和HERC2 mRNA表達水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 心肌肥厚患者心肌組織中肥厚標志基因和HERC2基因表達水平Table 2 The expression of hypertrophic fetal marker genes and HERC2 in myocardial tissues from patients and control donors

2.2HERC2在心肌肥厚大鼠中表達增加 Ang Ⅱ組ANP、BNP、MYH7和HERC2 mRNA表達水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 大鼠肥厚心肌組織中肥厚標志基因和HERC2表達水平Table 3 Expression of hypertrophic fetal marker genes and HERC2 in myocardial tissues from control rats and rats infused with angiotensin Ⅱ

2.3在心肌細胞中用siRNA方法沉默HERC2基因 與干擾對照組(si-NC)比較，HERC2干擾組(si-HERC2)中HERC2的mRNA和蛋白水平顯著下降，見圖1、表4。

圖1 Western blot檢測siRNA敲低HERC2的表達
Figure1siRNA-mediated knockdown of HERC2by western bloting

2.4HERC2敲低抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大 與PBS si-NC組比較，Ang Ⅱ si-NC組的細胞心肌細胞面積顯著增大(P<0.01)，并且Ang Ⅱ si-NC組心肌肥厚標志基因ANP(P<0.01)、BNP和MYH7(P<0.01)的表達顯著上調(diào)。和Ang Ⅱ si-NC組相比，Ang Ⅱ si-HERC2組的心肌細胞面積顯著減小(P<0.01)，并且心肌肥厚標志基因ANP、BNP和MYH7(P<0.01)的表達顯著下調(diào)。見表5。

2.5敲低HERC2抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的PI3K-AKT信號的激活 PI3K-AKT信號的激活是促進心肌肥厚的重要細胞內(nèi)信號之一，抑制PI3K-AKT信號可以抑制心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展和心力衰竭的發(fā)生。Ang Ⅱ可以顯著地激活PI3K-AKT信號通路，敲低HERC2可以顯著的抑制 PI3K-AKT信號活性。見圖2。

表4 siRNA敲低HERC2的mRNA表達Table 4 siRNA-mediated knockdown of HERC2 mRNA level in cardiomyocytes

表5 敲低HERC2表達抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大Table 5 Knockdown of HERC2 expression inhibited Ang Ⅱ-induced cardiac myocyte hypertrophy

*P值<0.05與PBS Si-NC組比較 #P值<0.05與Ang Ⅱ Si-NC組比較(Turkey檢驗)

圖2 敲低HERC2表達抑制Ang Ⅱ?qū)I3K-AKT信號的激活作用
Figure2Knockdown of HERC2inhibits Ang Ⅱ-induced activation of PI3K-AKT signaling

3 討 論

心肌肥厚分為病理型心肌肥厚和生理型心肌肥厚。妊娠可以誘發(fā)生理型肥厚，這種類型的心肌肥厚具有可逆性。高血壓、心肌梗死和神經(jīng)內(nèi)分泌等病理性刺激可以誘發(fā)病理型心肌肥厚。這種類型的心肌肥厚具有不可逆性[3]。持續(xù)的病理性刺激導(dǎo)致長期的心肌肥厚，并可能最終導(dǎo)致心肌纖維化、心律不齊和心力衰竭[4]。本研究探討了E3泛素連接酶HERC2在人和大鼠心肌肥厚中的功能和機制。發(fā)現(xiàn)HERC2在人和大鼠心肌肥厚過程中高表達。本研究表明HERC2促進Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚肥大和心肌肥厚標志基因的表達。機制研究表明HERC2可以抑制Ang Ⅱ?qū)I3K-AKT信號通路的激活作用。

蛋白質(zhì)的泛素化修飾對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性起著非常重要的調(diào)控作用[5]。以往的研究表明泛素化酶和去泛素化酶通過對特定靶蛋白進行修飾，從而在心肌肥厚過程中扮演者重要的角色[6]。HERC2是一種E3泛素連接酶[7]。但是，HERC2在心血管疾病中的功能尚不清楚。HERC2促進BLM和WRN解旋酶復(fù)合物與RPA相互作用，抑制g-四重態(tài)DNA[8]。此外，HERC2泛素連接酶對胚胎發(fā)育和調(diào)節(jié)運動協(xié)調(diào)至關(guān)重要[9]。但是，HERC2在心血管疾病中的功能尚不清楚。

為了研究HERC2在心血管疾病中的潛在功能，本研究首先分析了HERC2在患者心肌肥厚和大鼠心肌肥厚心肌組織中的表達譜變化，包括5例心肌肥厚患者和5例對照者的心肌組織，檢測了心肌肥厚標志基因和HERC2的表達水平，發(fā)現(xiàn)了HERC2在心肌肥厚組織中呈現(xiàn)高表達。隨后也在大鼠中用Ang Ⅱ誘導(dǎo)了大鼠心肌肥厚。同樣，分析了心肌肥厚標志基因和HERC2的表達水平，發(fā)現(xiàn)HERC2表達水平在大鼠心肌肥厚組織中同樣呈現(xiàn)出高表達。表明HERC2在心肌肥厚組織中高表達具有物種保守性，暗示著HERC2在心肌肥厚中起著一定的調(diào)控作用。

為了進一步明確HERC2在心肌肥厚中的功能，在體外構(gòu)建了心肌細胞肥大模型。利用siRNA在心肌細胞中敲低了HERC2的表達，隨后用Ang Ⅱ誘導(dǎo)了心肌肥厚。Ang Ⅱ刺激可以增大心肌細胞大小，促進心肌肥厚標志基因的表達，但是當(dāng)HERC2被敲低以后，Ang Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥厚的效應(yīng)被明顯剝奪。研究結(jié)果證明HERC2在Ang Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥厚過程中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，也提示HERC2可以作為治療心肌肥厚的潛在靶點。但是，還需要后續(xù)的研究證明HERC2是否在動物水平調(diào)節(jié)心肌肥厚。最后，探討了HERC2促進心肌肥厚的分子機制。心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展受到眾多細胞外和細胞內(nèi)信號的協(xié)同調(diào)控。心肌肥厚的發(fā)生是促心肌肥厚因素和抑制心肌肥厚因素不平衡引起[10]。在心肌肥厚過程中，細胞中多個信號節(jié)點被持續(xù)激活，這包括蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)信號、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號、蛋白激酶(protein kinase C，PKC)信號、PI3K-AKT信號等[11-12]。例如，細胞外生長因子和神經(jīng)分泌因子可以激活胞內(nèi)PI3K信號，PI3K信號可以磷酸化并激活A(yù)KT，AKT蛋白進一步通過糖原合酶激酶3β(Glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3b)等調(diào)控心肌肥厚相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，啟動心肌肥厚標志基因的表達。這些標志基因包括ANP、BNP和MYH7等[11]。PI3K-AKT信號在心肌肥厚過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[13-14]。多種病理刺激，如高血壓、心肌梗死和神經(jīng)內(nèi)分泌因素等，都可以激活PI3K-AKT信號通路，進而誘導(dǎo)心肌肥厚的發(fā)生[15]。但是PI3K-AKT如何被控制尚不完全清楚。本研究結(jié)果顯示，Ang Ⅱ可以激活PI3K-AKT的信號通路。但是，當(dāng)HERC2被敲低以后，Ang Ⅱ不能夠明顯的激活PI3K-AKT信號。這些實驗結(jié)果表明，在心肌肥厚過程中，PI3K-AKT信號通路受到HERC2的調(diào)控作用，而PI3K-AKT也是HERC2促進心肌肥厚的關(guān)鍵分子機制之一。

綜上所述，HERC2是一種保守的調(diào)控心肌肥厚的E3連接酶，HERC2可以通過調(diào)控PI3K-AKT信號通路的活性進而促進心肌肥厚。因此，HERC2可能作為將來治療心肌肥厚的潛在靶點之一。