趙麗莉 高宇 梁涢 羅毅

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種滑膜關(guān)節(jié)退行性疾病，在病程中滑膜組織可通過分泌致炎因子，造成軟骨下骨硬化、關(guān)節(jié)軟骨丟失、疼痛等，影響關(guān)節(jié)正常功能，致殘率較高，嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量，因此加強(qiáng)對(duì)OA 的研究具有重要意義[1]。半乳糖凝集素3（Galectin-3）可調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡等，在人工椎間盤病變患者標(biāo)本中可檢測(cè)到陽性表達(dá)，與椎間盤退變有關(guān)，并具有體外誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)的功能，故推測(cè)其可能與OA 有關(guān)[2]。骨形成蛋白-2（Bone morphogenetic protein-2，BMP-2）能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，加速前十字韌帶重建后的骨愈合，但在OA 中的研究較少[3]。本研究探究滑膜組織Galectin-3、BMP-2 在OA患者中的表達(dá)及臨床價(jià)值，報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 主要試劑

兔抗人Galectin-3 單克隆一抗、生物素化的二抗（美國(guó)Santa Cruz公司）；兔抗人BMP-2 單克隆一抗、生物素化的二抗（北京百奧萊博科技有限公司）；DAB 顯色劑（上海信裕生物科技有限公司）。

1.2 一般資料

選取本院2017年6月至2019年8月收治的OA患者126例作為觀察組，另選取同期因膝關(guān)節(jié)韌帶損傷或半月板損傷行關(guān)節(jié)鏡診治術(shù)患者124例作為對(duì)照組。兩組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、患病側(cè)、飲酒史、吸煙史、合并疾病等資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①OA組均符合OA 診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；②臨床資料完整；③無認(rèn)知、精神障礙；④單側(cè)病變者；⑤所有患者及家屬均已簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡者；②伴有血液系統(tǒng)疾病者；③存在惡性腫瘤者；④合并嚴(yán)重凝血功能障礙者；⑤伴有急性感染類疾病者。根據(jù)WOMAC 骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)[5]評(píng)估判斷病情程度研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn)。

表1 兩組臨床資料對(duì)比[n（%），（±s）]Table1 Comparison of clinical data between the 2 groups[n（%），（±s）]

表1 兩組臨床資料對(duì)比[n（%），（±s）]Table1 Comparison of clinical data between the 2 groups[n（%），（±s）]

資料年齡(歲)性別（男/女）體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）患病側(cè)左側(cè)右側(cè)飲酒史吸煙史合并疾病高脂血癥糖尿病心臟病高血壓觀察組（n=126）55.49±4.10 66/60 22.25±1.79 58（46.03）68（53.97）57（45.24）51（40.48）20（15.87）9（7.14）5（3.97）6（4.76）對(duì)照組（n=124）55.18±4.42 59/65 22.31±1.73 63（50.81）61（49.19）52（41.94）56（45.16）16（12.90）11（8.87）3（2.42）4（3.23）t/χ2值0.575 0.576 0.269 0.571 0.277 0.560 0.447 0.254 0.113 0.088 P值0.566 0.448 0.788 0.450 0.599 0.454 0.504 0.615 0.737 0.767

1.3 方法

1.3.1 滑膜組織Galectin-3、BMP-2表達(dá)

采用免疫組化染色法檢測(cè)，滑膜組織標(biāo)本固定，脫水，包埋，連續(xù)切片，60℃恒溫箱中烤片過夜，脫臘至水。3%雙氧水沖洗載玻片，PBS 液沖洗3次×5 min，復(fù)合酶37℃修復(fù)標(biāo)本10 min，按照1∶100 比例滴加兔抗人Galectin-3、BMP-2 單克隆一抗，37℃濕盒孵育1.5 h，室溫下復(fù)溫0.5 h，PBS沖洗3次×5 min。滴加生物素化的二抗，室溫靜置0.5 h，PBS 洗3次×5 min。滴加DAB 顯色劑顯色5 min，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，細(xì)胞膜、細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)有棕色顆粒附著為陽性，僅有片狀、黃染或無顆粒附著為陰性，通過IMage-Pro Plus6.0軟件分析，200倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，滑膜組織Galectin-3、BMP-2陽性表達(dá)率為滑膜組織陽性染色面積占視野下組織總面積的平均光密度。

1.3.2 關(guān)節(jié)液炎癥標(biāo)記物檢測(cè)

嚴(yán)格無菌操作，抽取患膝關(guān)節(jié)液1 mL，3 000 r/min 離心10 min 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)上清白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-8（Interleukin-8，IL-8）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor，TNF-α）表達(dá)，IL-6試劑盒購(gòu)于艾美捷科技有限公司，IL-8 購(gòu)于武漢賽培生物科技有限公司，TNF-α購(gòu)于齊一生物科技（上海）有限公司。

1.4 觀察指標(biāo)

①比較兩組滑膜組織Galectin-3、BMP-2 水平/濃度的差異。②分析滑膜組織Galectin-3、BMP-2與OA 診斷的關(guān)系。③比較不同OA 嚴(yán)重程度患者滑膜組織Galectin-3、BMP-2表達(dá)。④比較不同OA 嚴(yán)重程度患者關(guān)節(jié)液炎癥標(biāo)記物（IL-6、IL-8、TNF-α）水平。⑤分析滑膜組織Galectin-3、BMP-2與關(guān)節(jié)液炎癥標(biāo)記物相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示、χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較以單因素方差分析，兩兩比較以LSD-t 檢驗(yàn)，采用Logistic 分析滑膜組織Galectin-3、BMP-2與OA 發(fā)病的關(guān)系，采用Pearson 分析滑膜組織Galectin-3、BMP-2 與關(guān)節(jié)液炎癥標(biāo)記物相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組滑膜組織Galectin-3、BMP-2陽性表達(dá)率比較

觀察組滑膜組織Galectin-3、BMP-2陽性表達(dá)率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖1。

2.2 滑膜組織Galectin-3、BMP-2與OA發(fā)病的關(guān)系

Logistic回歸分析顯示，滑膜組織Galectin-3、BMP-2 與OA 診斷顯著相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表2 兩組滑膜組織Galectin-3、BMP-2 比較（±s）Table2 Comparison of Galectin-3 and BMP-2 in 2 groups of synovial tissues（±s）

表2 兩組滑膜組織Galectin-3、BMP-2 比較（±s）Table2 Comparison of Galectin-3 and BMP-2 in 2 groups of synovial tissues（±s）

組別觀察組對(duì)照組t值P值n 126 124 Galectin-3（%）42.47±6.78 5.82±1.39 58.985＜0.001 BMP-2（%）28.63±5.26 8.72±2.14 39.086＜0.001

表3 滑膜組織Galectin-3、BMP-2 與OA 發(fā)病的關(guān)系Table3 Relationship between galectin-3，BMP-2 and the incidence of OA in synovial tissue

2.3 不同OA 嚴(yán)重程度患者滑膜組織Galectin-3、BMP-2 的比較

滑膜組織Galectin-3、BMP-2陽性表達(dá)率隨病情程度增加呈升高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

2.4 不同OA 嚴(yán)重程度患者關(guān)節(jié)液炎癥標(biāo)記物

關(guān)節(jié)液IL-6、IL-8、TNF-α 水平隨病情程度增加呈升高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

2.5 滑膜組織Galectin-3、BMP-2 與關(guān)節(jié)液炎癥標(biāo)記物相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析，滑膜組織Galectin-3 與關(guān)節(jié)液IL-6（r=0.515）、IL-8（r=0.635）、TNF-α（r=0.620）呈正相關(guān)，滑膜組織BMP-2 與關(guān)節(jié)液IL-6（r=0.602）、IL-8（r=0.499）、TNF-α（r=0.634）呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

表4 不同病情程度患者滑膜組織Galectin-3、BMP-2比較（±s）Table4 Comparison of Galectin-3 and BMP-2 in synovial tissues of patients with different levels of disease（±s）

表4 不同病情程度患者滑膜組織Galectin-3、BMP-2比較（±s）Table4 Comparison of Galectin-3 and BMP-2 in synovial tissues of patients with different levels of disease（±s）

組別輕度患者中度患者重度患者F值P值n 38 56 32 Galectin-3（%）31.77±5.83 42.08±6.29 55.86±7.10 124.278＜0.001 BMP-2（%）20.05±4.16 27.44±5.27 40.90±6.74 132.326＜0.001

表5 不同病情程度患者關(guān)節(jié)液炎癥標(biāo)記物比較（±s）Table5 Comparison of synovial inflammation markers in patients with different disease levels（±s）

表5 不同病情程度患者關(guān)節(jié)液炎癥標(biāo)記物比較（±s）Table5 Comparison of synovial inflammation markers in patients with different disease levels（±s）

組別輕度患者中度患者重度患者F值P值n 38 56 32 IL-6（ng/L）13.15±3.82 35.94±10.20 61.08±16.33 169.027＜0.001 IL-8（ng/L）6.01±1.80 9.53±3.04 14.29±4.11 63.706＜0.001 TNF-α（ng/L）0.52±0.20 1.23±0.57 2.14±0.68 83.291＜0.001

3 討論

目前普遍認(rèn)為，OA是一種由滑膜、軟骨、骨等參與的炎癥性疾病，其炎癥通路是由IL-6、IL-8、TNF-α 等多種細(xì)胞因子參與的，各炎癥因子水平被證實(shí)與OA患者病情有關(guān)，能持續(xù)刺激滑膜、軟骨等，造成組織損傷，并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、基質(zhì)金屬蛋白酶分泌，導(dǎo)致滑膜增生、邊緣骨贅形成、關(guān)節(jié)間隙變窄等，從而誘發(fā)OA[6-7]。

Galectin-3是半乳糖凝集素家族中一個(gè)結(jié)構(gòu)獨(dú)特的成員，在多種組織中均有表達(dá)[8]。抑制Galectin-3 表達(dá)能明顯下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶3 表達(dá)，抑制核因子-κB 信號(hào)通路，減輕脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥損傷，呈現(xiàn)出軟骨保護(hù)特性[9]。本研究顯示，OA患者滑膜組織Galectin-3 表達(dá)高于因膝關(guān)節(jié)韌帶損傷或半月板損傷行關(guān)節(jié)鏡診治術(shù)患者，與OA診斷顯著相關(guān)，并隨病情嚴(yán)重程度增加呈升高趨勢(shì)。分析其原因，Galectin-3 可刺激成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，被激活的成纖維細(xì)胞可附著于骨組織和軟骨，逐漸破壞關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，并介導(dǎo)細(xì)胞黏附、白細(xì)胞趨化，參與炎癥反應(yīng)、組織纖維化，造成關(guān)節(jié)損傷，故在OA 中高表達(dá)，與OA 發(fā)病及患者病情有關(guān)[10-11]。Weinmann 等[12]報(bào)道顯示，Galectin-3 可誘導(dǎo)人骨關(guān)節(jié)炎中的IL-6、TNF-α 等，是OA 進(jìn)展的分子開關(guān)，支持本研究中滑膜組織Galectin-3 與關(guān)節(jié)液IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相關(guān)的觀點(diǎn)，佐證了Galectin-3 能通過炎癥因子參與OA 的發(fā)病?？梢姀幕蛩桨邢騁alectin-3，沉默或抑制Galectin-3 表達(dá)，可能有助于改善OA 的炎癥反應(yīng)情況，緩解或控制OA 病情，但這一結(jié)論仍需更多研究的論證。

BMP-2是驅(qū)動(dòng)成骨細(xì)胞分化和活性的必不可少的生長(zhǎng)因子，對(duì)骨形成至關(guān)重要[13]。本研究顯示，OA患者滑膜組織BMP-2表達(dá)高于因膝關(guān)節(jié)韌帶損傷或半月板損傷行關(guān)節(jié)鏡診治術(shù)患者，與OA發(fā)病顯著相關(guān)，與Weidner 等[14]報(bào)道相似，可能是由于OA 滑膜組織的炎癥反應(yīng)刺激及退行性變化，導(dǎo)致BMP-2 升高，進(jìn)而參與關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)。且本研究還發(fā)現(xiàn)，滑膜組織BMP-2陽性表達(dá)率隨病情程度增加呈升高趨勢(shì)，表明BMP-2 與OA患者病情有關(guān)，推測(cè)病情越嚴(yán)重，軟骨破壞可能更明顯，機(jī)體為修復(fù)軟骨產(chǎn)生適應(yīng)性或應(yīng)激性變化更大，分泌更多的BMP-2，以發(fā)揮修復(fù)作用[15]。同時(shí)滑膜組織BMP-2 與IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相關(guān)，這一現(xiàn)象是由于OA 局部的激烈炎癥反應(yīng)可能通過細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)啟動(dòng)了滑膜組織的成骨性能，從而使BMP-2 與促炎因子呈現(xiàn)出正相關(guān)變化[16]。而根據(jù)以往報(bào)道，IL-6、IL-8、TNF-α 均與OA 臨床癥狀嚴(yán)重程度、關(guān)節(jié)功能顯著相關(guān)，佐證了Galectin-3、BMP-2 與OA 發(fā)病和病情有關(guān)[17]。提示治療OA 時(shí)，不僅應(yīng)重視關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)的控制，亦應(yīng)從軟骨修復(fù)等角度干預(yù)，雙管齊下，可能有助于提高臨床治療效果。

綜上所述，滑膜組織Galectin-3、BMP-2 在OA患者中呈高表達(dá)，與OA 的發(fā)病和病情嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，并與關(guān)節(jié)液炎癥因子表達(dá)呈正相關(guān)，提示檢測(cè)滑膜組織Galectin-3、BMP-2 可輔助OA及其嚴(yán)重程度的診斷和預(yù)后的判斷。