張諾 郭明蔚 陳桂武 李剛

強直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）屬一種以脊柱慢性炎癥為主要特征的慢性風(fēng)濕性疾病，藥物治療為AS 主要治療手段，治療關(guān)鍵在于減輕炎癥，緩解臨床癥狀，避免畸形，維持正常姿勢與最佳功能位置[1]。柳氮磺吡啶屬治療AS 傳統(tǒng)藥物，雖具有一定療效，但作用有限，且副作用較大[2]。益賽普屬腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）拮抗類藥物，能抑制TNF-α 表達，阻斷其引起的炎癥反應(yīng)，減輕患者病情[3]。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a、miR-146a 等miRNAs 于自身免疫功能及多種炎癥調(diào)節(jié)過程中具有重要作用，可參與風(fēng)濕性疾病發(fā)生、進展[4-5]。但關(guān)于益賽普聯(lián)合柳氮磺吡啶治療對AS 患者疾病治療效果及外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中miR-29a、miR-146a 表達影響如何尚不明確，本研究通過前瞻性研究對其進行分析。如下報道。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取本院2016年8月至2019年8月AS 患者123例進行前瞻性隨機對照研究，以隨機數(shù)字表將患者分為對照A組（n=41）、對照B組（n=41）、觀察組（n=41）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

納入標準：①符合《強直性脊柱炎的診斷與治療骨科專家共識》中AS 臨床診斷標準[6]；②初診患者；③入組前2個月未應(yīng)用改善病情藥物；④疾病處在活動期；⑤患者知曉本研究，自愿簽訂知情同意書。排除標準：①合并心、腎、肝等臟器功能嚴重障礙；②合并腦血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤；③伴有結(jié)核感染；④合并精神、認知功能障礙；⑤依從性差，無法配合完成治療；⑥對研究應(yīng)用藥物過敏。

1.2 方法

1.2.1 治療方法

①對照A組給予益賽普（三生國健藥業(yè)（上海）股份有限公司，國藥準字S20050059）治療：25 mg 益賽普加入1 mL 生理鹽水，在三角肌下緣采取皮下注射，起始劑量2次/周，待患者病情緩解后逐漸降低應(yīng)用劑量，9～12周減量到25 mg/周，若出現(xiàn)減量后病情反復(fù)，可回調(diào)劑量。②對照B組給予柳氮磺吡啶（上海信誼天平藥業(yè)有限公司，國藥準字H31020557）治療：1.0 g/次，2次/d，口服。③觀察組給予益賽普聯(lián)合柳氮磺吡啶：益賽普應(yīng)用劑量與方法同對照A組，柳氮磺吡啶應(yīng)用劑量與方法同對照B組。3組均治療12周。

1.3.2 檢測方法

①血清炎癥因子檢測：采集患者清晨空腹靜脈血樣5 mL，取3 mL 血樣以離心機離心10 min（轉(zhuǎn)速：2 500 r/min 離心半徑：10 cm），提取血清，低溫凍存待檢；以免疫比濁法測定血清C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）水平，雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定血清TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（Matrix metalloproteinase-3，MMP-3）水平，檢測試劑盒均購于武漢默沙克生物科技有限公司，有關(guān)操作嚴格按試劑盒說明書執(zhí)行。②PBMCs 中miR-29a、miR-146a 檢測：取2mL 血樣以Ficoll 分離液分離出PBMCs，按Trizol試劑盒說明書提取PBMCs 中Small RNA，放置到無RNA 酶水內(nèi)保存；設(shè)計及合成引物，引物合成與測序均由生工生物工程上海（股份）有限公司完成；合成cDNA，應(yīng)用美國ABI公司提供的7300 熒光定量PCR 儀以實時熒光定量PCR 法測定PBMCs 中miR-29a、miR-146a 水平，每個標本測定3個復(fù)孔，以2-△Ct計算血清miR-29a、miR-146a 相對表達量。

1.4 療效評價

治療12周依據(jù)國際AS 評價工作組（Assessment of Spondyloarthritis International So-ciety，ASAS）標準[7]評價療效，以達到AS 療效評價標準20%改善（ASAS20）歸為改善，未達到為無效，ASAS20 定義：與治療前相比，總體評價（Patient global assessment，PGA）、脊柱炎癥、夜間痛與脊柱痛視覺模擬評分量表（Visual analogue scale，VAS）分值、Bath 強直性脊柱炎功能指數(shù)（Bath ankylosing spondylitis functional index，BASFI）4項指標中≥3項改善在20%及以上，且VAS 分值降低≥1分。改善率=改善例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.5 觀察指標

3組治療12周后療效。3組治療前、治療4、8、12周后癥狀與病情改善情況[脊柱痛、晨僵時間、AS活動指數(shù)（BASDAI）評分]，脊柱痛應(yīng)用VAS 量表評價，總分10分，分值越高疼痛程度越高，AS 活動指數(shù)包括關(guān)節(jié)疲倦、腫脹、疼痛程度等維度，總分10分，分值越高病情越嚴重[8]。3組治療前、治療4、8、12周后血清炎癥因子指標（CRP、TNF-α、MMP-3）水平。④3組治療前、治療4、8、12周后PBMCs 中miR-29a、miR-146a 水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（）表示，t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料用n（%）表示，行χ2檢驗；等級資料應(yīng)用Ridit 分析，Z檢驗；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組基本資料的比較

3組年齡、體質(zhì)量、病程、性別、吸煙與飲酒人數(shù)比例、病變部位、CT 分期等一般資料相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 3組一般資料比較[n（%），（±s）]Table1 Comparison of three groups of general data[n（%），（±s）]

表1 3組一般資料比較[n（%），（±s）]Table1 Comparison of three groups of general data[n（%），（±s）]

資料年齡（歲）體質(zhì)量（kg）病程（年）性別（男/女，例）吸煙飲酒病變部位 雙側(cè)單側(cè)CT 分期 Ⅳ期Ⅲ期Ⅱ期觀察組（n=41）30.82±4.13 61.94±6.42 2.85±0.64 25/16 8（19.51）13（31.71）14（34.15）27（65.85）4（9.76）20（48.78）17（41.46）對照A組（n=41）31.42±4.56 62.76±7.14 3.02±0.49 23/18 9（21.95）11（26.83）13（31.71）28（68.29）5（12.20）21（51.22）15（36.59）對照B組（n=41）30.49±5.07 62.27±6.56 2.93±0.56 24/17 11（26.83）13（31.71）16（39.02）25（60.98）3（7.32）24（58.54）14（34.15）F/Z/χ2值0.430 0.155 0.624 0.201 0.647 0.309 0.501 0.253 P值0.651 0.857 0.400 0.904 0.724 0.857 0.779 0.969

2.2 臨床療效

41例治療12周后臨床療效改善率比較結(jié)果顯示，觀察組最高39（95.12%），其次是對照A組32（78.05%），最低是對照B組25（60.98%），而無效率則是對照B組最高16（39.02%），其次是對照A組9（21.95%），最低是觀察組2（4.88%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.95，P＜0.05）。

2.3 癥狀與病情改善情況、炎癥因子、miR-29a、miR-146a 水平

3組治療前脊柱痛、晨僵時間、BASDAI 評分、血清CRP、TNF-α、MMP-3及PBMCs 中miR-29a、miR-146a 水平相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療4周、8周、12周后脊柱痛、晨僵時間、BASDAI評分、血清CRP、TNF-α、MMP-3及PBMCs 中miR-29a、miR-146a 水平比較結(jié)果為：觀察組＜對照A組＜對照B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

3 討論

AS 可造成反復(fù)腰背疼痛、四肢關(guān)節(jié)腫痛，病情嚴重者甚至?xí)霈F(xiàn)受累關(guān)節(jié)功能喪失、脊柱畸形等，累及全身多種系統(tǒng)。柳氮磺吡啶可于腸道中降解成5-氨基水楊酸，發(fā)揮抗炎、免疫抑制效果，緩解因各類炎癥造成的臨床癥狀，減輕病情[9]。但單純應(yīng)用柳氮磺吡啶治療對部分患者療效不佳。

表3 3組癥狀與病情改善情況、炎癥因子、miR-29a、miR-146a 水平比較（±s）Table3 Comparison of symptoms and improvement of condition，inflammatory factors，miR-29a，miR-146a levels in 3 groups（±s）

表3 3組癥狀與病情改善情況、炎癥因子、miR-29a、miR-146a 水平比較（±s）Table3 Comparison of symptoms and improvement of condition，inflammatory factors，miR-29a，miR-146a levels in 3 groups（±s）

時間治療前治療4周后治療8周后治療12周后組別觀察組對照A組對照B組F值P值觀察組對照A組對照B組F值P值觀察組對照A組對照B組F值P值觀察組對照A組對照B組F值P值n 41 41 41 41 41 41 41 41 41 41 41 41癥狀與病情改善情況脊柱痛（分）6.03±1.24 5.97±1.31 5.92±1.16 0.081 0.922 3.04±1.01 4.22±1.10 5.17±1.24 37.172＜0.001 2.63±0.41 3.08±0.45 3.61±0.53 45.430＜0.001 1.84±0.32 2.97±0.36 3.38±0.41 195.552＜0.001晨僵時間（min）48.23±14.57 47.64±16.03 47.17±15.22 0.050 0.952 21.34±5.63 28.79±7.02 40.06±10.21 58.987＜0.001 16.57±4.45 22.18±6.09 29.10±7.23 44.386＜0.001 12.48±3.11 17.15±4.06 23.60±4.79 78.103＜0.001 BASDAI評分（分）6.05±1.34 6.11±1.28 5.98±1.41 0.096 0.909 3.56±0.81 4.33±0.86 5.02±0.93 29.024＜0.001 3.07±0.42 3.74±0.50 4.39±0.67 61.217＜0.001 2.37±0.35 2.88±0.41 3.42±0.44 70.035＜0.001炎癥因子CRP（mg/L）31.55±6.28 30.46±5.71 30.72±6.03 0.368 0.693 20.12±4.07 24.33±4.25 28.14±4.81 34.269＜0.001 15.13±3.49 19.34±3.61 23.39±4.12 49.738＜0.001 12.31±3.16 15.42±3.50 19.93±4.08 46.437＜0.001 TNF-α（μg/mL）411.38±54.26 412.53±57.29 410.77±56.07 0.011 0.990 354.20±27.10 382.26±30.02 405.31±31.17 30.908＜0.001 334.52±24.06 362.29±25.11 387.30±28.19 42.783＜0.001 315.04±30.44 334.27±32.38 368.19±40.14 24.839＜0.001 MMP-3（pg/mL）110.58±12.15 112.06±14.03 111.62±11.88 0.146 0.864 91.26±8.02 98.17±8.43 106.69±10.14 30.846＜0.001 85.33±6.61 92.20±8.34 101.38±9.57 38.939＜0.001 78.30±9.17 85.19±10.22 96.21±11.36 31.609＜0.001 miR-29a 0.80±0.20 0.78±0.17 0.81±0.22 0.245 0.783 0.56±0.10 0.68±0.11 0.76±0.13 31.959＜0.001 0.43±0.11 0.54±0.12 0.67±0.13 40.906＜0.001 0.30±0.10 0.42±0.12 0.61±0.17 56.385＜0.001 miR-146a 2.21±0.34 2.23±0.31 2.18±0.28 0.269 0.765 1.51±0.17 1.87±0.20 2.06±0.22 81.825＜0.001 1.02±0.24 1.40±0.31 1.85±0.36 74.952＜0.001 0.78±0.23 1.02±0.25 1.44±0.30 66.830＜0.001

臨床研究指出，TNF-α 于免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等方面起著重要作用，可刺激滑膜與軟骨成纖維細胞生成前列腺素E、膠原酶等，加速骨吸收及骨質(zhì)破壞，阻止骨膠原生成，引起局部炎癥，參與AS發(fā)病與病程進展過程[10]?？梢娍筎NF-α 生成為治療AS 重要靶點。益賽普屬典型TNF-α 拮抗劑，田軍偉等[11]研究報道，應(yīng)用益賽普治療AS 患者可顯著改善患者臨床癥狀與關(guān)節(jié)功能，提升療效。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用益賽普聯(lián)合柳氮磺吡啶治療后患者臨床癥狀與病情改善，療效提升，與上述研究相符。推究其原因為益賽普主要由TNF-α 受體p75 胞外段和人IgG1 Fc 段相融合而形成，能不可逆地競爭性結(jié)合血漿與細胞表面TNF-α，抑制TNF-α 生物學(xué)活性，減輕機體炎癥，緩解AS 病情[12]。將益賽普、柳氮磺吡啶結(jié)合應(yīng)用可由不同途徑減輕機體炎癥，緩解病情，進而增強治療效果。同時，CRP 屬促炎性細胞因子，可參與免疫調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，與TNF-α 一同參與AS 炎癥反應(yīng)發(fā)生、進展過程；MMP-3 為MMPs家族中一員，可起到降解細胞外基質(zhì)與基質(zhì)重塑作用，且與骨破壞、關(guān)節(jié)軟骨病、炎性關(guān)節(jié)疾病等有關(guān)，表達與TNF-α、CRP 水平呈正相關(guān)，屬判定AS 病情的重要指標物[13]。本研究中，應(yīng)用益賽普聯(lián)合柳氮磺吡啶治療后血清CRP、TNF-α、MMP-3 水平顯著改善，亦證實聯(lián)合治療可減輕機體炎癥反應(yīng)，抑制病情進展。

近期研究報道，miR-29a 可直接靶向調(diào)控Dickkopf-1 的3′UTR 區(qū)域，加速Wnt/β-catenin 信號通路激活，提高成骨細胞堿性磷酸酶、骨鈣素等有關(guān)因子表達；miR-146a 能阻止白細胞介素-1 受體有關(guān)激酶1 與TNF 受體有關(guān)因子6 表達，加速破骨細胞生成，促進骨質(zhì)破壞，2者表達與AS 疾病活動性密切相關(guān)[14-15]。本研究中，應(yīng)用益賽普聯(lián)合柳氮磺吡啶治療后PBMCs 中miR-29a、miR-146a 水平明顯降低。原因可能與應(yīng)用益賽普聯(lián)合柳氮磺吡啶治療后機體炎癥減輕，骨質(zhì)破壞減弱，病情緩解等有關(guān)，但具體機制仍有待將來進一步探討。

綜上，聯(lián)合應(yīng)用益賽普與柳氮磺吡啶治療AS 患者能緩解機體炎癥反應(yīng)，下調(diào)PBMCs 中miR-29a、miR-146a表達，減輕臨床癥狀、病情，提高療效。