韓雪松 丁雪 趙鵬 于輝 辛衛(wèi)娟★

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，是女性生殖系統(tǒng)常見的腫瘤，隨著女性生活飲食行為習(xí)慣的改變，每年的新發(fā)病例呈迅猛上升趨勢(shì)，在我國(guó)已成為僅次于宮頸癌的導(dǎo)致死亡的常見婦科惡性腫瘤[1]。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病原因迄今尚不明確，許多研究證明其涉及除雌孕激素外的許多其他分子通路及機(jī)制[2]。近年來大量國(guó)內(nèi)外研究指出子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展與非編碼RNA 密切相關(guān)[3-5]。研究表明MicroRNA（miRNA）是mRNA 編碼蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)因子，對(duì)基因表達(dá)、細(xì)胞分化、凋亡乃至個(gè)體發(fā)育產(chǎn)生重要影響，其中miR-205-5p 在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，有文獻(xiàn)報(bào)道LncRNA（Long non-coding RNAs，LncRNAs）對(duì)miRNA有內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)抑制作用[6]。本實(shí)驗(yàn)前期研究在含有miR-205-5p 結(jié)合位點(diǎn)的LncRNA 中篩選出在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)下調(diào)的LncRNA-LA16C-313D11.11，并證實(shí)其與miR-205-5P 具有競(jìng)爭(zhēng)抑制作用[7]。但其在子宮內(nèi)膜癌中的具體作用尚未可知，本研究旨在明確LA16c-313D11.11和miR-205-5p 在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年1月至2016年2月在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的子宮內(nèi)膜癌手術(shù)標(biāo)本60例?；颊吣挲g26～76歲，中位年齡55歲。收集同期子宮內(nèi)膜非典型增生組織20例（患者年齡37～53歲，中位年齡47歲）和正常子宮內(nèi)膜組織20例（患者年齡49～61歲，中位年齡49歲）作為對(duì)照組，正常子宮內(nèi)膜組織來源于因子宮良性疾?。ㄈ缱訉m脫垂或子宮肌瘤等）行子宮切除術(shù)后證實(shí)子宮內(nèi)膜組織正常者。3組年齡有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者術(shù)前均未行化療、放療或激素治療且均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者術(shù)前曾接受激素或放化療治療且未簽署知情同意書者。

1.2 方法

實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR 檢測(cè)LA16c-313D11.11和miR-205-5p 表達(dá)情況按照Trizol（Invitrogen，USA）試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA 提取，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄使用Prime ScriptTM RT試劑盒（Takara，Japan），按說明書操作。采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物。LA16c-313D11.11 引物：上游5′-TGAAGGA GGTTATTGACGCA；下 游：5′-GAGGGGAAACAGTCCAGAGT。miR-205-5p 引物：上游：5′-TCCACCGGAGTCTGTCTCAT；下游：5′-GCTGTCAACGATACGCTACG。GAPDH 引物：上游：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3；下游：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。采用SYBR Premix ExTaq TM試劑盒（Takara，Japan）和Rotor-Gene3000 系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)及測(cè)定。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用（）表示，兩組間用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析方差不齊者采用非參數(shù)檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用等級(jí)資料Spearman 秩相關(guān)，以r=0 作為判斷相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組病理檢查結(jié)果

LA16c-313D11.11和miR-205-5p 在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況。見圖1。

LA16c-313D11.11 在正常組織、EAH 組織及子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)結(jié)果為EC組最低，其次為EAH 組，最高是正常組，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-205-5p 的表達(dá)在正常組織、EAH 組織及子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)結(jié)果為EC組最高，其次是EAH 組，最低是正常組，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.2 LA16c-313D11.11和miR-205-5p 的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

以中位值作為截?cái)?，將表達(dá)量大于等于中位值的LA16c-313D11.11 定義為高表達(dá)組，表達(dá)量小于中位值定義為低表達(dá)組。發(fā)現(xiàn)LA16c-313D11.11 低表達(dá)與FIGO 晚期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)果表明，低表達(dá)LA16c-313D11.11 與更具侵襲性的子宮內(nèi)膜癌表型相關(guān)，miR-205-5p 的表達(dá)也與FIGO 分期及淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05）。見表1。

2.3 LA16c-313D11.11與miR-205-5p表達(dá)的相關(guān)性

在正常子宮內(nèi)膜組織和EAH 中LA16c-313D11.11和miR-205-5p 的表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在EC組中Spearman 相關(guān)分析呈現(xiàn)負(fù)性相關(guān)（P<0.05，rs＝-0.305）。見表2。

表1 LA16c-313D11.11/miR-205-5p 表達(dá)與腫瘤臨床病理指標(biāo)的關(guān)系[n（%）]Table1 Association of LA16c-313D11.11 and miR205-5p expression with the clinicopathological characteristics of patients with EC[n（%）]

3 討論

miRNA是內(nèi)源性的大小在20～25 nt 的一類非編碼RNA，在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄成70～100 nt 的雙鏈發(fā)夾狀前體RNA 并經(jīng)過Dicer 酶和Drosha 酶的分步切割，進(jìn)入RISC 復(fù)合體中，通過與靶mRNA 的3′端非編碼區(qū)（3′-UTR）不完全配對(duì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶mRNA 表達(dá)或介導(dǎo)靶mRNA 降解。miRNA 最早于1993年在線蟲身上發(fā)現(xiàn)[8]，后續(xù)研究闡明其參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括發(fā)育、造血、器官形成、凋亡、細(xì)胞增殖，甚至腫瘤發(fā)生[9-11]。Daikoku 等[10]在小鼠子宮內(nèi)存在于所有的多細(xì)胞生物中，同時(shí)具有一定的保守性，提示其在多種生物反應(yīng)過程中膜癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)miR-199a、miR-101a下調(diào)。Todd 等[12]在對(duì)正常子宮內(nèi)膜、不典型增生內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌的研究中，發(fā)現(xiàn)了13個(gè)差異表達(dá)顯著的miRNA，其中下調(diào)的miRNA 5個(gè)（1et-7i，miR-221，miR-193，miR-152，miR-30c），上調(diào)的miRNA 8個(gè)（miR-185，miR-106a，miR-181a，

表2 LA16c-313D11.11 與miR-205-5p 在不同子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)的相關(guān)性Table2 correlation between LA16c-313D11.11 and miR-205-5p expression in different endometrial tissues

miR-210，miR-423，miR-103，miR-107，let-7c）。Loffe YJ 等[13]研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株AN3CA和KLE 中miR-19b、miR-20a、miR-21、miR-26a 高表達(dá)。Lee H 等[14]在對(duì)正常子宮內(nèi)膜、異常增生子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌組織的研究中發(fā)現(xiàn)miR-182、miR-183、miR-200a、miR-200c和miR-205 在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)。Karaayvaz M 等[15]對(duì)正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中的miR-200c和miR-205-5p 的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-205-5p 不僅可以作為子宮內(nèi)膜癌診斷的一個(gè)有效標(biāo)志物，而且能預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者的臨床預(yù)后。

LncRNA是一類長(zhǎng)度介于200 nt～100 kb 之間的非編碼RNA，位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，在真核細(xì)胞中普遍被轉(zhuǎn)錄。越來越多的證據(jù)表明，LncRNA與癌癥的發(fā)生存在密切的關(guān)系[16]。LncRNA 差異表達(dá)于正常組織與其相應(yīng)不典型增生的組織及腫瘤中，而且特異性LncRNA 可作為腫瘤的預(yù)測(cè)因子[17]。Gibb 等[18]從人類正常組織到人類癌組織描寫LncRNA 轉(zhuǎn)錄譜，在癌癥中存在異常的LncRNA表達(dá)譜。應(yīng)激介導(dǎo)長(zhǎng)鏈非編碼轉(zhuǎn)錄體5（long stressinduced non-coding transcript-5，LSINCT5）是一個(gè)在細(xì)胞核集中分布，大小為2.6 kb 的多聚腺苷酸，相對(duì)于正常的組織，LSINCT5 在乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞系及腫瘤組織中存在過量表達(dá)，敲除LSINCT5 能明顯抑制癌細(xì)胞增殖并伴隨多種基因的表達(dá)下調(diào)，推測(cè)LSINCT5 可能是通過調(diào)節(jié)下游的靶基因，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮致癌作用[19]。Gloss 等[20]研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)潛在的卵巢癌的表觀遺傳標(biāo)志物L(fēng)OC134466，研究顯示該LncRNA 在II型漿液性卵巢癌CpG 島存在高達(dá)81%甲基化（81/100），而其它不同類型卵巢癌僅為7.7%（1/13），因此認(rèn)為該標(biāo)志物對(duì)II型漿液性卵巢癌診斷具有潛在價(jià)值。LncRNA-MALAT1通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)影響宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)移[21]。Akrami 等[22]研究發(fā)現(xiàn)在漿液性卵巢腺癌中位于1號(hào)染色體上的LncRNA-OVAL 轉(zhuǎn)錄激活，同樣的現(xiàn)象發(fā)生在包括子宮內(nèi)膜癌在內(nèi)的其他16種癌癥中。這說明體細(xì)胞LncRNA 可以特別針對(duì)人類基因組擴(kuò)增，發(fā)揮作用參與腫瘤的發(fā)生或發(fā)展。

綜上所述，本研究闡明了LA16c-313D11.11 對(duì)子宮內(nèi)膜癌增殖侵襲的影響，以及在子宮內(nèi)膜癌中LA16c-313D11.11 可能通過內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)抑制miR-205-5p 發(fā)揮作用，這將為子宮內(nèi)膜癌的治療提供更有效的思路。后續(xù)研究我們將進(jìn)一步明確其作用機(jī)制，從而對(duì)子宮內(nèi)膜癌的診斷和治療提供新的依據(jù)。