馬雯 張偉宏 馬瑛龍 葸靜 金哲宇，5 樸文花★

新型冠狀病毒（2019 Novel Coronavirus，2019-nCoV）引起的肺炎廣泛傳播，并在全球蔓延。國際病毒分類協(xié)會將其命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2），隨后世界衛(wèi)生組織公布其基因組序列，并將該病毒導(dǎo)致的疾病命名為COVID-19（Corona Virus Disease 2019）[1-2]。國家衛(wèi)生健康委多次印發(fā)新型冠狀病毒肺炎診療方案，始終將逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcription Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）檢測新型冠狀病毒的核酸作為確診及治療監(jiān)測的重要指標(biāo)[3]?，F(xiàn)已注冊的新冠病毒核酸檢測試劑多以開放閱讀框架1ab（Open Reading Frame 1ab，ORF1ab）基因、核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N）基因及包膜蛋白（Envelope，E）基因為檢測對象，同時攜帶內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)（Internal Control，IC）基因，實現(xiàn)對新型冠狀病毒的核酸檢測[4]。有醫(yī)院發(fā)現(xiàn)新冠核酸檢測結(jié)果存在假陰性較高，與臨床癥狀不相符，不同廠家檢測試劑盒結(jié)果不一致等問題[5-6]。影響新冠病毒核酸檢測結(jié)果的因素很多，盡管多數(shù)實驗室都在關(guān)注檢測試劑的性能，但實際上，核酸純度及濃度在RT-qPCR 檢測過程中也十分重要，因此基于目前所出現(xiàn)的問題，本實驗室通過收集6種新型冠狀病毒核酸提取試劑盒的基本情況，比較其核酸提取效果及RT-qPCR擴(kuò)增結(jié)果等參數(shù)，綜合分析試劑盒的性能，為使用者合理選擇試劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2020年2月15日至2020年2月29日就診本院發(fā)熱門診的20例疑似新型冠狀病毒感染者的鼻咽部拭子作為標(biāo)本，按照規(guī)定轉(zhuǎn)運(yùn)至分子生物學(xué)實驗室立即檢測，檢測前置于65℃水浴滅活20 min。

1.2 實驗方法

使用RT-qPCR擴(kuò)增新型冠狀病毒核酸。所有檢測嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理辦法》（國衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）[7]、《國家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒實驗室生物安全指南（第二版）的通知》（國衛(wèi)辦科教函〔2020〕70號）[8]及《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術(shù)指南（第四版）》（國衛(wèi)辦疾控函〔2020〕109號）[9]相關(guān)文件進(jìn)行實驗操作和生物安全防護(hù)。

1.3 儀器與試劑

核酸提取使用杭州奧盛K30型干浴儀高溫干浴，離心使用安徽嘉文JW-2018H 高速冷凍離心機(jī)；提取的核酸使用NanoDrop One 微紫外/可見分光光度計測量核酸濃度、核酸純度，檢測前使用各試劑盒中提供的洗脫液作空白對照；新型冠狀病毒基因擴(kuò)增使用ABI 7500 實時熒光定量PCR儀，檢測試劑使用中山大學(xué)達(dá)安基因提供的新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（批號：2020017），設(shè)置熒光檢測通道及反應(yīng)程序，按照說明書要求，當(dāng)N基因、ORF1ab基因及IC基因的擴(kuò)增通道出現(xiàn)明顯的S型曲線，且Ct值均≤40，可判定為陽性結(jié)果。

選擇已獲得國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的可用于新型冠狀病毒核酸提取純化的試劑盒，并對試劑盒隨機(jī)編號為A（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，批號為2020003）、B（圣湘生物科技股份有限公司，批號為2020002）、C（上海之江生物科技股份有限公司，批號為P20200101）、D（上海科華生物工程股份有限公司，批號為20026530）、E（江蘇碩世生物科技股份有限公司，批號為20200110）、F（羅氏診斷有限公司，批號為43556600）。

4個陽性標(biāo)本提取的核酸使用各公司試劑盒內(nèi)提供的洗脫液按照1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200的稀釋度倍比稀釋，立即進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 22.0軟件。計量資料用（）表示組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)使用多元方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。圖表使用GraphPad Prism 8.0.2 軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 核酸提取試劑盒的基本情況

6種新冠病毒核酸提取試劑盒的基本情況見表1。

表1 核酸提取試劑盒基本情況表Table1 Baseline data of 2019-nCoV extraction kits

2.2 核酸濃度及純度的比較

不同試劑盒所提取的核酸在濃度方面比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果為A＞F＞D＞B＞E＞C。核酸純度中最高檢測值為A試劑盒，剩下依次為E、D、F、C、B，6種試劑盒之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見表2。

表2 核酸濃度及純度的比較（±s）Table2 Comparison of total RNA concentration and purity（±s）

表2 核酸濃度及純度的比較（±s）Table2 Comparison of total RNA concentration and purity（±s）

試劑盒ABCDEF P值n 20 20 20 20 20 20核酸濃度（ng/μL）75.499±13.565 6.827±1.925 2.252±0.965 15.912±3.038 6.548±2.151 46.666±13.404＜0.001核酸純度2.802±0.244 1.815±0.108 1.826±0.446 2.347±0.405 2.705±0.414 1.978±0.214＜0.001

2.3 擴(kuò)增結(jié)果分析

RT-qPCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，6種試劑盒所提核酸均能檢出4份標(biāo)本的N基因、ORF1ab基因及IC基因（Ct值≤40），可判定為陽性。其他16份標(biāo)本只有IC基因可檢出，判定為陰性。

分析擴(kuò)增后IC基因的Ct值及△Rn值。F試劑盒提取的總RNA 擴(kuò)增后的Ct值最小，其次為D試劑、E試劑、B試劑、C試劑和A試劑（見圖1A），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。擴(kuò)增后得到的熒光曲線中，A試劑的ΔRn值最高，其次為F試劑、E試劑、D試劑、C試劑、B試劑（見圖1B），差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

分析4個陽性標(biāo)本N基因及ORF1ab基因的擴(kuò)增數(shù)據(jù)。不同試劑提取的核酸擴(kuò)增后，N基因中的Ct值A(chǔ)＜D＜E＜F＜B＜C（如圖2A），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。N基因的ΔRn值中，A試劑最高，其次為F試劑、D試劑、C試劑、E試劑及B試劑（如圖2B），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ORF1ab基因Ct值與ΔRn值的比較中，如圖2C、2D，呈現(xiàn)出與N基因相同的趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 核酸稀釋后擴(kuò)增結(jié)果的比對

對4個陽性標(biāo)本稀釋后再擴(kuò)增。F試劑提取的核酸在1∶3 200 稀釋時可將4個陽性標(biāo)本的IC基因、N基因、ORF1ab基因均檢出。C試劑提取的核酸在1∶1 600 稀釋時可以檢出3個IC基因，3個N基因及1個ORF1ab基因。其他幾種試劑盒在1∶1 600 稀釋時均有未檢出的基因。統(tǒng)計各試劑所提核酸經(jīng)稀釋后檢出的陽性樣本數(shù)目，如圖3A。4個陽性樣本在不同的稀釋后，3次重復(fù)實驗中，F(xiàn)試劑可檢出各稀釋度下所有的陽性樣本，在1∶1 600 的稀釋時C試劑檢出2個陽性樣本，其他幾種試劑均未檢出陽性樣本，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002＜0.05，F(xiàn)=12.82）。分析不同稀釋度擴(kuò)增后3個基因的Ct值，見如圖3B、3C、3D，F(xiàn)試劑的提取效率最好，擴(kuò)增曲線的Ct值在1∶800、1∶1 600和1∶3 200 的稀釋度時，均低于其他幾種試劑。

3 討論

RT-qPCR因其靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單且耗時短[10]，成為新型冠狀病毒核酸檢測的主要方法。但使用RT-qPCR 檢測新冠病毒出現(xiàn)假陰性率高、檢測結(jié)果與臨床癥狀不吻合等報道，備受關(guān)注[5-6]。在影響新冠病毒核酸檢測結(jié)果的眾多因素中，高質(zhì)量、高純度核酸是檢測成功的必備條件。本次所選核酸提取試劑盒均為手工提取，包括膜吸附柱法、磁珠柱法和磁珠法。膜吸附柱法耗時長，但穩(wěn)定性好，重復(fù)性高。磁珠法操作方便，用時少，價格低廉[11]，二者相比各有所長。對提取出的總RNA 分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)試劑盒提取出的核酸品質(zhì)最高。C試劑盒提取出的核酸純度雖符合要求，但濃度偏低，分析可能與其標(biāo)本起始量過低相關(guān)。試劑盒A 提取的核酸雖然濃度高，但其核酸純度不理想。質(zhì)量較好的RNA 純度A260/A280 比值應(yīng)在1.8～2.0 之間，比值小于1.8 時，提示溶液中可能存在蛋白質(zhì)或酚類的污染；大于2.0 時，或因RNA或已水解成單核苷酸導(dǎo)致，另一方面現(xiàn)有核酸提取試劑多使用異硫氰酸胍，其殘留也會增加A260/A280 的比值。

Ct值為熒光信號達(dá)到閾值時所需的循環(huán)數(shù)，它與起始模板的濃度負(fù)相關(guān)，可以代表PCR 的擴(kuò)增效率。ΔRn值是熒光PCR 在扣除背景信號后的熒光值，能反映擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量。Ct值與ΔRn值的差異顯示不同核酸提取試劑盒對新冠病毒核酸檢測結(jié)果會產(chǎn)生影響。按比例對陽性標(biāo)本的核酸進(jìn)行稀釋，并進(jìn)行擴(kuò)增分析，F(xiàn)試劑檢出陽性樣本數(shù)量最多，其次為C試劑，6種試劑盒相比差異明顯。由此可見，核酸的濃度及純度對新型冠狀病毒核酸檢測的結(jié)果有直接且顯著的影響。

在新冠肺炎核酸檢測方面各家實驗室對試劑盒的評價不一致[12-13]，一方面可能是各試劑盒上市倉促，質(zhì)量和性能有待優(yōu)化，另一方面也與實驗室條件、操作人員檢測經(jīng)驗、操作水平相關(guān)。本實驗通過檢測20例標(biāo)本結(jié)果比對認(rèn)為，市售的6種核酸提取試劑盒中，F(xiàn)試劑盒在提取效果及陽性標(biāo)本的檢出率方面均優(yōu)于其他5種試劑盒，但其成本較高，常規(guī)實驗室可能無法使用。其他5種試劑成本接近，因此各實驗室可根據(jù)實驗?zāi)康?，樣本量多少以及實驗室?jīng)費(fèi)等情況，選擇適合的新冠病毒核酸提取試劑盒。