孫志兵，楊 娟

糖尿病在中國已經(jīng)成為影響居民生活質(zhì)量的主要問題之一，在經(jīng)濟(jì)發(fā)展、生活條件富足以及人口老齡化等多種因素驅(qū)使下，糖尿病的發(fā)病人數(shù)仍在逐年上升[1-2]。糖尿病發(fā)病機(jī)制主要為胰島素相對(duì)分泌不足及胰島素抵抗，2型糖尿病是我國主要的糖尿病類型，胰島素抵抗在2型糖尿病發(fā)病中發(fā)揮重要作用[3-4]。當(dāng)前對(duì)于介導(dǎo)胰島素抵抗信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有較多研究，其中有關(guān)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3，SOCS3)介導(dǎo)胰島素抵抗信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究也有一定進(jìn)展[5-6]，但目前較少有文獻(xiàn)對(duì)SOCS3介導(dǎo)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起胰島素抵抗進(jìn)行報(bào)道。本研究通過構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型，探討慢病毒介導(dǎo)沉默SOCS3基因?qū)Υ笫笙嚓P(guān)胰島素通路蛋白表達(dá)的影響?，F(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性5周齡SD大鼠40只，購自北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司，大鼠許可證號(hào)：SCXK(京)20170011，體質(zhì)量170～230 g，所有SD大鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作程序符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南》規(guī)定，本實(shí)驗(yàn)研究方案通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)試劑購自美國Sigma公司；空慢病毒載體購自北京義翹神州科技有限公司；葡萄糖測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠胰島素ELISA試劑盒購自上海一基實(shí)業(yè)有限公司；血脂生化檢測試劑盒購自上海透景診斷科技有限公司；Trizol RNAiso購自日本Takara公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒購自北京九州天瑞科技有限公司；總RNA提取試劑盒購自北京凱瑞基生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Applied Biosystems公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京金克隆生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠SOCS3蛋白、胰島素受體底物1(insulin receptor substrate-1，IRS1)、磷酸化IRS1(pIRS1)、胰島素受體底物2(insulin receptor substrate-2，IRS2)、磷酸化IRS2(pIRS2)、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子-5b(signal transducers and activators of transcription-5b，STAT5b)、磷酸化STAT5b(pSTAT5b)一抗購自美國Novus Biologicals公司；兔抗鼠酪氨酸激酶2(janus kinase 2，JAK2)、磷酸化JAK2(pJAK2)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子-3(signal transducers and activators of transcription-3，STAT3)、磷酸化STAT3(pSTAT3)一抗均購自美國Abcam公司；羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自美國Santa Cruz公司。KETA S凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Wealtec Corp公司；PCR儀購自美國Bio-rad公司，CFX96型；全自動(dòng)生化分析系統(tǒng)購自美國Beckman Coulter公司，AU5800型。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒介導(dǎo)沉默SOCS3基因構(gòu)建 慢病毒SOCS3 RNAi構(gòu)建由北京義翹神州科技有限公司完成，載體構(gòu)建完成后由該公司提供基因測序結(jié)果，由我實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行確認(rèn)。

1.2.2 大鼠糖尿病模型構(gòu)建及分組 大鼠糖尿病模型構(gòu)建：40只大鼠給予高糖高脂飼料(配比：膽固醇5%、豬油脂10%、蔗糖10%、普通飼料65%)喂養(yǎng)，飼養(yǎng)4周后，大鼠腹腔注射STZ緩沖液(STZ溶液1%，檸檬酸緩沖液99%)30 mg/kg。注射5 d后，隨機(jī)3次測量鼠尾血糖，血糖值>16.7 mmol/L為大鼠2型糖尿病模型構(gòu)建成功。建模成功大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、空白載體組和觀察組，各10只。分組后1、15 d，觀察組大鼠尾部注射SOCS3 RNAi慢病毒載體，每次1.5 mL；空白載體組大鼠尾部注射空慢病毒載體，每次1.5 mL；空白對(duì)照組不進(jìn)行處理。繼續(xù)飼養(yǎng)4周，所有大鼠禁食，收集血清、肝臟組織標(biāo)本，肝臟組織標(biāo)本于-80 ℃保存待檢。

1.2.3 大鼠血糖、血脂和胰島素水平檢測 載體注射4周后，檢測大鼠空腹血糖、胰島素、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及總膽固醇(TC)水平。其中空腹血糖采用葡萄糖氧化酶法檢測，胰島素測定采用ELISA法，HDL-C、TG、LDL-C和TC采用全自動(dòng)生化分析儀測定。

1.2.4 RT-PCR檢測大鼠肝臟組織相關(guān)mRNA表達(dá) 取大鼠肝臟組織1 g，以研磨棒充分研磨，加入1 mL Trizol RNAiso，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄操作參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，提取20 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，GAPDH、SOCS3、IRS1、IRS2、STAT5b、JAK2、STAT3引物由北京義翹神州科技有限公司合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，循環(huán)完成后在72 ℃條件下繼續(xù)延伸10 min。采用FS2000系統(tǒng)進(jìn)行分析，并采用2-△△CT法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 各目的基因引物序列

1.2.5 Western blotting法檢測大鼠肝臟組織相關(guān)蛋白表達(dá) 取大鼠肝臟組織1 g，以研磨棒充分研磨，加入1 mL RIPA細(xì)胞裂解液，各組細(xì)胞在冰上裂解30 min，移入1.5 mL離心管中，在預(yù)冷的4 ℃離心機(jī)中5 000 r/min離心5 min后提取上清，95 ℃煮沸后，收集蛋白備用。提取40 μg總蛋白，在120 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，采用電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，室溫下用50 g/L脫脂奶粉進(jìn)行封閉2 h。隨后加入稀釋的兔抗鼠SOCS3、IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、STAT5b、pSTAT5b、JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3一抗(1∶1 000)，在4 ℃條件下進(jìn)行孵育過夜備用。第2天用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)稀釋液洗滌孵育后的溶液3次，然后加入山羊抗兔稀釋二抗(1∶1 000)孵育2 h，用PBST稀釋液洗滌3次，然后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯影液處理樣本。采用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠體質(zhì)量比較 3組大鼠均精神狀態(tài)較好，毛發(fā)光滑。3組大鼠入組時(shí)和注入載體后4周體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；構(gòu)建糖尿病模型后，空白載體組和觀察組大鼠體質(zhì)量均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，空白載體組和觀察組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 3組大鼠不同時(shí)點(diǎn)體質(zhì)量比較

q檢驗(yàn)：與空白對(duì)照組比較**P<0.01

2.2 3組大鼠血糖、胰島素和血脂水平比較 觀察組大鼠空腹血糖、胰島素、TG、LDL-C和TC水平均明顯低于空白對(duì)照組和空白載體組(P<0.01)，HDL-C水平均明顯高于空白對(duì)照組和空白載體組(P<0.01)；空白對(duì)照組和空白載體組大鼠上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

表3 3組大鼠血糖、胰島素和血脂水平比較

q檢驗(yàn)：與空白對(duì)照組比較**P<0.01；與空白載體組比較△△P<0.01

2.3 3組大鼠相關(guān)mRNA表達(dá)水平比較 除STAT3 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，3組大鼠SOCS3 mRNA、STAT5b mRNA、IRS1 mRNA、IRS2 mRNA及JAK2 mRNA表達(dá)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中，觀察組大鼠SOCS3 mRNA和STAT5b mRNA表達(dá)均明顯低于空白對(duì)照組和空白載體組(P<0.01)，IRS1 mRNA、IRS2 mRNA和JAK2 mRNA表達(dá)均高于空白對(duì)照組和空白載體組(P<0.05～P<0.01)；空白對(duì)照組和空白載體組相關(guān)mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。

表4 3組大鼠相關(guān)mRNA表達(dá)比較

q檢驗(yàn)：與空白對(duì)照組比較**P<0.01；與空白載體組比較△P<0.05，△△P<0.01

2.4 3組大鼠相關(guān)通路蛋白表達(dá)比較 除STAT3蛋白表達(dá)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，3組大鼠相關(guān)通路蛋白表達(dá)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中，觀察組SOCS3、STAT5b、pSTAT5b蛋白表達(dá)均明顯低于空白對(duì)照組和空白載體組(P<0.01)，IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、JAK2、pJAK2、pSTAT3蛋白表達(dá)均明顯高于空白對(duì)照組和空白載體組(P<0.01)；空白對(duì)照組和空白載體組各通路蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表5)。

表5 3組大鼠胰島素通路蛋白表達(dá)的比較

分組npSTAT5bJAK2pJAK2STAT3pSTAT3 空白對(duì)照組101.02±0.202.00±0.210.88±0.091.90±0.201.00±0.12 空白載體組101.03±0.182.01±0.230.87±0.101.89±0.231.01±0.11觀察組100.73±0.12??△△2.32±0.19??△△1.23±0.09??△△1.96±0.171.29±0.18??△△F—10.037.4648.130.3513.80 P—<0.01<0.01<0.01>0.05<0.01 MS組內(nèi)—0.0290.0440.0090.0410.020

q檢驗(yàn)：與空白對(duì)照組比較**P<0.01；與空白載體組比較△△P<0.01

3 討論

SOCS3基因參與了多個(gè)細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，目前認(rèn)為其主要通過JAK-STAT信號(hào)通路對(duì)相關(guān)因子發(fā)揮作用。有研究[7-8]顯示，其在糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮一定作用。有研究[9]通過不同小鼠模型誘導(dǎo)SOCS3基因失活，對(duì)瘦素敏感性及胰島素抵抗進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)失活SOCS3基因?qū)κ菟氐谋磉_(dá)有一定影響，并通過瘦素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)血糖變化，同時(shí)降低了胰島素抵抗作用。WANG等[10]對(duì)糖尿病小鼠進(jìn)行FGF-21基因敲除，對(duì)血糖、胰島素、STAT3-SOCS3通路蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，小鼠糖原異生、糖原分解增加，而后血糖水平升高，同時(shí)降低了STAT3-SOCS3通路磷酸化水平，導(dǎo)致胰島素抵抗增加，也進(jìn)一步印證了STAT3-SOCS3通路的激活與胰島素抵抗有一定相關(guān)性。本研究沉默SOCS3基因表達(dá)后，對(duì)STAT5b介導(dǎo)信號(hào)通路蛋白表達(dá)及血清指標(biāo)變化進(jìn)行檢測，以探討SOCS3介導(dǎo)胰島素抵抗的信號(hào)通路情況。

本研究以STZ誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型，共30只大鼠構(gòu)建成功，在注射載體4周后，大鼠體質(zhì)量差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究[11]顯示，在糖尿病大鼠飼料中添加苦瓜提取物，能夠有效降低大鼠體質(zhì)量，同時(shí)大鼠肝臟中SOCS3及JNK基因表達(dá)具有明顯差異，說明苦瓜提取物影響大鼠體質(zhì)量過程中，SOCS3可能參與了胰島素抵抗的過程，進(jìn)而影響體質(zhì)量變化。這與本研究結(jié)論不一致，原因可能包括選取的試劑不一致、研究目的不同，可能還存在其他通路影響大鼠的胰島素抵抗水平，因此得到結(jié)論存在差異。在血清指標(biāo)方面，觀察組大鼠血糖、胰島素水平均低于其他2組，分析其原因可能為沉默SOCS3基因表達(dá)后，能夠降低胰島素抵抗，從而降低血糖。ZHOU等[12]對(duì)幽門螺桿菌感染誘導(dǎo)肝臟胰島素抵抗信號(hào)通路進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，SOCS3在幽門螺桿菌介導(dǎo)胰島素抵抗中發(fā)揮了一定作用，支持本研究結(jié)果。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)觀察組血脂指標(biāo)變化也優(yōu)于其他2組，我們推測SOCS3基因表達(dá)與血脂指標(biāo)具有一定相關(guān)性，擬在以后的研究中進(jìn)行進(jìn)一步探索。

本研究對(duì)SOCS3基因和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，觀察組表達(dá)水平低于其他2組，提示慢病毒介導(dǎo)沉默SOCS3基因載體注入后，達(dá)到了預(yù)期目的，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做好了準(zhǔn)備；而空白對(duì)照組和空白載體組在基因表達(dá)方面未見差異，排除慢病毒載體的干擾。結(jié)合上述空腹血糖和胰島素表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)SOCS3在胰島素抵抗病理機(jī)制中發(fā)揮了作用，與相關(guān)研究[13-15]結(jié)論一致。此外，觀察組STAT5b mRNA低于其他2組，IRS1 mRNA、IRS2 mRNA及JAK2 mRNA高于其他2組，而3組STAT3 mRNA無明顯差異，提示下調(diào)SOCS3基因表達(dá)可抑制STAT5b mRNA，增加IRS1 mRNA、IRS2 mRNA及JAK2 mRNA的表達(dá)，對(duì)STAT3 mRNA的表達(dá)影響不大。

本研究結(jié)果顯示，在信號(hào)通路蛋白表達(dá)及磷酸化方面，沉默SOCS3基因后，抑制了STAT5b蛋白及其磷酸化，上調(diào)了IRS1、IRS2蛋白表達(dá)及磷酸化。推測可能為SOCS3基因通過調(diào)節(jié)STAT5b的表達(dá)及磷酸化介導(dǎo)IRS1、IRS2的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)胰島素抵抗。有研究[16]顯示，上調(diào)SOCS3表達(dá)可下調(diào)IRS1表達(dá)，同時(shí)增加IRS1磷酸化，進(jìn)而介導(dǎo)胰島素抵抗，與本次研究結(jié)論存在差異，還需進(jìn)一步研究探討。我們?cè)谘芯恐羞€發(fā)現(xiàn)，下調(diào)SOCS3基因后，JAK2的表達(dá)水平及磷酸化增加，STAT3磷酸化增加，但STAT3蛋白表達(dá)未見明顯增加，分析可能為SOCS3不僅介導(dǎo)了JAK2/STAT3通路，過程中可能STAT3蛋白也介導(dǎo)了其他通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。MAHONY等[17-18]提出，SOCS3是多種細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基礎(chǔ)，SOCS3高表達(dá)通過調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路介導(dǎo)糖尿病發(fā)生。BLUYSSEN等[19]研究指出，SOCS3基因與 JAK2/STAT3通路互相形成一個(gè)反饋回路，糖尿病病人出現(xiàn)胰島素抵抗時(shí)，伴隨著多種細(xì)胞因子增加，激活JAK2/STAT3通路，誘導(dǎo)SOCS3表達(dá)增加，同時(shí)SOCS3又能夠負(fù)反饋調(diào)節(jié)JAK2/STAT3通路，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)胰島素抵抗。這與本研究結(jié)果存在差異。而張旭等[20]研究顯示，SOCS3通過負(fù)性調(diào)節(jié)STAT3活化，介導(dǎo)胰島素抵抗，支持本次研究結(jié)論?？烧J(rèn)為目前該通路介導(dǎo)胰島素抵抗的機(jī)制尚不十分準(zhǔn)確，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

綜上，SOCS3可能通過相關(guān)信號(hào)通路介導(dǎo)胰島素抵抗，沉默SOCS3基因，可介導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路抑制胰島素抵抗，進(jìn)而改善糖尿病癥狀。