于芃，馬思聰，代新春，蔣敏，曹瑞華，張繼彬，韓東，李蘇雷，曹豐*

(1空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 710032；2解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學中心，解放軍總醫(yī)院國家老年疾病臨床醫(yī)學研究中心，北京 100853)

近年來，高血壓、冠心病等心血管疾病發(fā)病率不斷升高，這些疾病最后可進展為心力衰竭(heart failure,HF)，嚴重威脅人類的生命健康[1,2]。心肌纖維化(cardiac fibrosis)是心血管疾病中的主要過程，可引起心臟的收縮及(或)舒張功能下降，最終導致HF[3]。研究顯示，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)的激活是HF進展的關鍵因素[4]，其中血管緊張素Ⅱ(angiotension Ⅱ,AngⅡ)作為RAS的主要生物肽，通過增強結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)-趨化因子FKN信號的激活，在心肌間質(zhì)纖維化過程中起重要作用，導致心肌肥大、心臟功能障礙及心臟損傷的加重[5]。Sirtuin 6(SIRT6)是一種保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去乙?；?，已被證實在調(diào)節(jié)心臟功能、能量代謝以及衰老中起重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，HF患者心臟中SIRT6表達水平顯著降低[7]。目前以SIRT6為靶點的藥物研發(fā)受到廣泛關注。煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)是哺乳動物體內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotina-mide adenine dinucleotide,NAD+)補救合成途徑的中間體[8]，NMN具有修復腦功能、改善胰島素抵抗及促進心臟損傷修復的重要作用[9]。本研究通過使用微量泵泵入AngⅡ構建小鼠心肌纖維化模型，并通過腹腔注射NMN，觀察NMN抑制小鼠心肌纖維化的作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用實驗動物為SPF級雄性C57/BL6J小鼠，40只，體質(zhì)量25～30 g，8周齡；煙酰胺單核苷酸(NMN)購自中國湯普森有限公司；異氟烷購自河北一品公司；Trizol試劑(Invitrogen，CA)和Prime Script RT試劑盒(TAKARA，Japan)均購自武漢谷歌生物科技有限公司；SIRT6抗體、CollagenⅠ抗體、Collagen Ⅲ抗體、α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體及內(nèi)參Tublin抗體均購自英國Abcam公司；微量泵Osmotic Pump，Model 1004購自美國Alzet 公司。所用設備包括：小鼠心臟超聲系統(tǒng)(Vevo?2100 VisualSonics，Canada)；血壓測定儀(MOUSE CUFF Bp-98A，Softron Co Japan)；酶標儀(Thermo，US)和Bio-Rad成像系統(tǒng)(BioRad，US)等。

1.2 小鼠模型分組

使用異氟烷麻醉小鼠，取俯臥位固定小鼠，背部剃毛消毒，用剪刀剪開約2 cm皮下組織，心肌纖維化模型小鼠組埋入已預裝 Ang Ⅱ 1.6 mg/(kg·d)[10]的微量泵，對照組埋入預裝等量蒸餾水的微量泵，均皮下持續(xù)泵入給藥4周。各取10只給予NMN腹腔注射[300 mg/(kg·d)]，注射時間為手術后即刻至術后4周。實驗動物共分為4組，分別為心肌纖維化模型小鼠組(模型組)，生理鹽水正常對照組(對照組)，心肌纖維化模型小鼠 + NMN(模型 + NMN組)，生理鹽水正常對照 + NMN(對照 + NMN組)，每組各10只小鼠。

1.3 超聲心動圖檢測小鼠心臟變化

異氟烷吸入麻醉小鼠，心前區(qū)脫毛后取仰臥位，經(jīng)胸行超聲檢查，探頭頻率為2～4 MHz，測量左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter,LVESD)，左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)和左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPWT)。左室收縮功能通過左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fraction shortening,LVFS)進行評估，具體為LVEF(%)=(LVEDV-LDESV)/LVEDV×100%和LVFS(%)=(LVEDD-LVESD)/LVEDD ×100%。

1.4 小鼠血壓測量

采用尾套測壓法測量小鼠血壓(blood pressure，BP)，具體操作為：使用血壓測定儀在術前1周及術后4周在小鼠清醒狀態(tài)下對小鼠尾動脈進行血壓測量，共測量3次，取平均值[11]。

1.5 實時定量PCR

藥物處理4周，小鼠血壓及心功能測定完成后，4組小鼠各取3只處死，切取心臟速凍備用。使用Trizol試劑從速凍小鼠心臟中提取總核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)。使用Prime Script RT試劑盒合成cDNA。在ABI 7900T實時系統(tǒng)(Applied，Biosystems，CA)中，使用SYBR Premix ExTaq Ⅱ(TAKARA，Japan)進行定量實時PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測。引物序列如表1。GAPDH作為內(nèi)參。

表1 實時定量PCR引物序列

RT-qPCR: real-time quantitative polymerase chain reaction; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; SIRT6: Sirtuin 6; α-SMA: α-smooth muscle actin.

1.6 Western blot分析

使用二喹啉甲酸(bicinchonininc acid,BCA)法(BioRad，US)測定整個心臟裂解物的蛋白質(zhì)濃度。將整個組織裂解物進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳，隨后轉膜至聚偏氟乙烯(polyvinylidene uoride,PVDF)膜。5%蛋白封閉液封閉2 h，孵一抗過夜，孵二抗，通過化學發(fā)光法檢測目標蛋白質(zhì)。

1.7 心肌纖維化染色

小鼠麻醉后處死，分離心臟組織，4%多聚甲醛固定后脫水，石蠟包埋，切片厚度5 μm，分別對切片進行HE染色及Masson染色。使用Image-Pro Plus 6.0軟件對Masson染色圖像進行心肌膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)分析[12]。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 4組小鼠基線情況

4組小鼠在手術前均進行超聲心動圖檢測及血壓測定，結果顯示4組小鼠的基線情況一致，心功能指標及血壓未見統(tǒng)計學差異(P>0.05；表2)。

表2 4組小鼠基線情況

GroupLVESD(mm)LVEDD(mm)LVPWT(mm)BP(mmHg)Control0.313±0.0420.128±0.0150.064±0.006104.27±13.31Model0.327±0.0450.124±0.0170.068±0.009103.39±12.47Control+NMN0.318±0.0390.126±0.0180.065±0.007104.78±14.29Model+NMN0.323±0.0440.129±0.0210.062±0.005105.02±15.35

NMN: nicotinamide mononucleotide; LVESD: left ventricular end-systolic diameter; LVEDD: left ventricular end diastolic diameter; LVPWT: left ventricular posterior wall thickness.BP: blood pressure.1 mmHg=0.133 kPa.

2.2 4組小鼠術后心功能改變

通過心臟超聲對小鼠心功能進行評估，發(fā)現(xiàn)模型 + NMN組及模型組小鼠均表現(xiàn)出顯著的心臟肥大和心肌纖維化，但模型 + NMN組小鼠的心臟肥大和心肌纖維化程度顯著低于模型組，而對照組和對照 + NMN組小鼠較術前無顯著差異，均優(yōu)于模型 + NMN組及模型組小鼠(圖1A)。對照組和對照 + NMN組的LVEF以及LVFS較術前均無顯著變化，而模型 + NMN組及模型組小鼠的LVEF以及LVFS較術前和同期對照組和對照 + NMN組顯著下降，但模型 + NMN組的LVEF、LVFS下降程度顯著低于模型組(P<0.05；圖1B,C)。對小鼠血壓進行測量發(fā)現(xiàn)，對照組和對照 + NMN組小鼠較術前無顯著差異，但模型 + NMN組及模型組小鼠的血壓顯著上升，而模型組小鼠上升程度高于模型 + NMN組(P<0.05；圖1D)。

2.3 4組小鼠術后病理改變

通過HE染色觀察4組小鼠心肌變化發(fā)現(xiàn)，對照組及對照 + NMN組小鼠心肌細胞排列規(guī)則，無心肌細胞肥大；而模型組可見明顯肥大的心肌細胞，且心肌細胞排列紊亂，細胞間質(zhì)明顯增多；模型 + NMN組則未見明顯的肥大心肌細胞，且心肌細胞排列與模型組相比更規(guī)則，細胞間質(zhì)變化較對照組及對照 + NMN組也未見明顯改變(圖2A)。通過Masson染色法觀察4組小鼠心肌間膠原含量發(fā)現(xiàn)，對照組及對照給藥組的CVF無明顯變化，而實驗組CVF出現(xiàn)明顯上升，而實驗給藥組上升程度較低(P<0.05；圖2A,B)。

2.4 NMN對于小鼠心肌纖維化相關基因及蛋白表達的影響

通過實時定量PCR及Western blot分析NMN對小鼠心肌纖維化相關基因及蛋白表達的影響發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠的SIRT6表達明顯降低，模型 + NMN組及對照 + NMN組小鼠的SIRT6表達均增加，但對照 + NMN組的SIRT6表達要明顯高于模型 + NMN組；同時，Collagen Ⅰ、CollagenⅢ以及α-SMA在4組中的表達趨勢與SIRT6相反(P<0.05；圖3A,B)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，心肌纖維化是各種心血管疾病導致HF的重要過程，而NMN可有效改善心血管功能[13]。在本研究中，我們通過微量泵入AngⅡ，構建小鼠心肌纖維化模型，隨后通過給予NMN腹腔注射進行干預。結果發(fā)現(xiàn)，NMN可有效改善由AngⅡ引起的心肌纖維化，其機制可能是通過上調(diào)心肌細胞中的SIRT6抑制了與心肌纖維化相關的Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ以及α-SMA的表達。

心肌纖維化的致病因素主要包括炎癥、應激或容量負荷、糖尿病以及年齡[14]，其中炎癥細胞可分泌AngⅡ、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白細胞介素(interleukine-6,IL-6)等激活心臟成纖維細胞，導致炎癥區(qū)域發(fā)生不同程度的纖維化[15]。有文獻表明，RAS與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關，而AngⅡ是RAS中的重要因子，參與了心臟重塑的過程[16]。本研究通過微量泵輸注AngⅡ成功制備了心肌纖維化模型，并發(fā)現(xiàn)模型組和模型 + NMN組小鼠心臟中SIRT6表達較對照組和對照 + NMN組小鼠相比顯著降低。SIRT6是心血管疾病中的重要保護因子，大量研究表明，SIRT6與RAS系統(tǒng)之間存在相互作用[17]，SIRT6可以通過激活AMPK-ACE2信號和抑制CTGF-FKN途徑來抑制心臟的病理性重塑、纖維化和心肌損傷過程，從而起到保護心臟的作用[18]。SIRT6已越來越多地被用作藥物靶點，通過藥物刺激心臟SIRT6表達上調(diào)，從而達到治療目的。有學者通過慢病毒載體介導的SIRT6過表達，發(fā)現(xiàn)心肌細胞中端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)和端粒重復結合因子(telomere repeat binding factor,TRF)-1的表達升高，并通過組織學分析證實了SIRT6對于心肌具有保護作用[6]。Muraoka等[19]發(fā)現(xiàn)，小鼠近端腎小管特異性敲除Nampt使得SIRT6表達下調(diào)，因此，他們認為Nampt-Sirt6軸是糖尿病腎病中纖維化發(fā)生的細胞外基質(zhì)重塑的關鍵因素。而Nampt經(jīng)過體內(nèi)代謝，可以轉化為NMN[20]，因此我們推測NMN可能也具備上調(diào)SIRT6表達的能力。本研究通過腹腔注射NMN，發(fā)現(xiàn)給藥后小鼠心臟SIRT6表達明顯上調(diào)，且心肌纖維化程度得到明顯逆轉。當前，NMN在帕金森病、腦卒中和糖尿病腎病的治療中已取得一定的進展[21]。本研究通過腹腔注射NMN，發(fā)現(xiàn)給藥組小鼠心臟SIRT6表達明顯上調(diào)，心肌纖維化程度顯著逆轉，為心肌纖維化的治療提供了新的思路和方向。

圖1 4組小鼠術后心功能改變

圖2 4組小鼠術后病理改變

圖3 NMN對于小鼠心肌纖維化相關基因及蛋白表達的影響

綜上所述，煙酰胺單核苷酸可顯著抑制Ang Ⅱ 所致的小鼠心肌纖維化，且該作用是通過激活SIRT6，抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 以及α-SMA的表達來實現(xiàn)的。本研究雖然為治療心肌纖維化提供了新的思路和方向，但仍有一定局限性，機制探索不夠深入，并且需要進一步使用SIRT6抑制劑來對NMN抑制AngⅡ致小鼠心肌纖維化的SIRT6途徑進行驗證。