趙云龍，李少軍，陳平，劉陽(yáng)

(1解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心胸外科，北京 100048; 2解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心胸外科，北京 100853)

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一[1]。大多數(shù)肺癌患者早期并無(wú)明顯癥狀，很多患者確診時(shí)已處于中晚期且伴有病灶遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因而失去外科手術(shù)切除或放療的機(jī)會(huì)[2]。美國(guó)2019年癌癥生存統(tǒng)計(jì)報(bào)告數(shù)據(jù)表明，約3/4的肺癌幸存者年齡≥65歲，肺癌確診的中位年齡為70歲，老年人已成為肺癌的高發(fā)人群[3]。近年來(lái)，肺癌的新型治療藥物不斷問(wèn)世，其中，分子靶向治療藥物由于其特異性強(qiáng)和毒副反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，為老年肺癌患者提供了更多治療選擇。但是，該類藥物因其適應(yīng)證存在局限性，并不適合大多數(shù)老年肺癌患者。以鉑類藥物為主的聯(lián)合化療方案仍然是老年肺癌治療的標(biāo)準(zhǔn)一線化療方案。但是，隨著鉑類化療藥物在臨床中的廣泛應(yīng)用，腫瘤細(xì)胞對(duì)此類藥物的耐藥性也逐漸增強(qiáng)，從而導(dǎo)致化療療效明顯降低，這給老年肺癌的治療帶來(lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)；另一方面，由于老年患者的重要器官功能均存在一定程度的衰退，因藥物耐受性欠佳等原因，很多老年患者不得不選擇放棄化療[4]。

microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非蛋白編碼的小分子RNA，約18～24個(gè)核苷酸，可通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)序列相結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)靶mRNA的降解或基因沉默[5]。大量研究表明，miRNA對(duì)幾乎所有已知的癌變過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、血管生成、細(xì)胞凋亡以及侵襲和轉(zhuǎn)移均具有調(diào)節(jié)作用[6]。miR-200c作為miRNA家族的成員，已成為近年的研究熱點(diǎn)，其在惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用備受關(guān)注[7]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c家族作為重要的抑癌基因在肺癌組織中呈低表達(dá)。近年有研究報(bào)道，miR-200c在正常干細(xì)胞與乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)顯著下調(diào)，證實(shí)miR-200c過(guò)表達(dá)可通過(guò)靶向干細(xì)胞再生因子BMI-1顯著抑制乳腺癌干細(xì)胞的干性特征[8,9]。然而，miR-200c在肺癌耐藥性中的作用機(jī)制尚不完全清楚。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和A549/順鉑(cisplatin, DDP)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心；順鉑和染色試劑噻唑蘭(MTT)購(gòu)自Sigma生物公司；脂質(zhì)體2000 購(gòu)自Invitrogen 生物公司；兔抗人β-actin、TUBB3、survivin和Bcl-2單克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；siRNA由上海吉瑪生物科技有限公司合成。

1.2 細(xì)胞準(zhǔn)備

采用含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞及其順鉑耐藥株A549/DDP，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。以miR-200c模擬物(miR-200c mimics)分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞并設(shè)陰性對(duì)照(negative control, NC)組。

1.3 MTS法檢測(cè)miR-200c對(duì)細(xì)胞耐藥性的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2×104/ml密度接種于96孔板，每孔100 μl，放置過(guò)夜使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。將不同濃度的順鉑加入到對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后吸去培養(yǎng)基，加入100 μl 0.5 mg/ml 的MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。孵育結(jié)束后，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(A490 nm)，并根據(jù)公式[細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A490 nm/對(duì)照組A490 nm)×100%]計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。以順鉑濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)作圖并擬合抑制曲線，求得IC50值。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

首先根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組以miR-200c mimics轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，以PBS緩沖液洗滌2次；取細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)的細(xì)胞懸液，離心并棄去上清液，加入195 μl結(jié)合液，再次輕輕反復(fù)吹打細(xì)胞懸液后，加入5 μl AnnexinV-FITC混勻，在室溫和避光環(huán)境下繼續(xù)孵育10 min后，離心，棄上清液。再加入10 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)，混勻，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。以上步驟重復(fù)操作3次。

1.5 檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞中多種蛋白的表達(dá)

取miR-200c mimics轉(zhuǎn)染的、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP細(xì)胞裂解液提取蛋白。采用二辛可寧酸法測(cè)定細(xì)胞裂解液中的蛋白含量。12%SDS-PAGE電泳分離后，采用半干轉(zhuǎn)移法將分離膠內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。用5%脫脂奶粉TBS-T緩沖液(25 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1% Tween 20，pH7.5)封閉PVDF膜后洗膜，滴加一抗；4℃下過(guò)夜培養(yǎng)，洗滌去除一抗后，加HRP標(biāo)記的二抗在室溫下孵育2 h，洗膜；凝膠成像分析系統(tǒng)曝光成像并分析圖像，以β-actin為內(nèi)參照計(jì)算蛋白的相對(duì)含量。

1.6 采用實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)miR-200c和TUBB3mRNA的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃ 20 s，95℃ 10 s，60℃ 20 s，70℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-200c表達(dá)量以2-ΔΔCT表示。miR-200c反轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTG-GATACGACTCCATC-3′；PCR上游引物：5′-GGTAATACTGCCGGGTAAT-3′，下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。TUBB3上游引物:5′-AAAGAATTCGACGCCACGGCCGAGGAAGAGG-3′，下游引物:5′-AAAAAGCTTAAGGGTATCTGACAGCAATAGA-3′。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞株的miR-200c表達(dá)情況

A549轉(zhuǎn)染組中的miR-200c的表達(dá)水平顯著高于A549/DDP轉(zhuǎn)染組(P<0.001；圖1A)；A549/DDP miR200c mimics 轉(zhuǎn)染組中的miR-200c表達(dá)水平明顯高于NC組(P<0.01；圖1B)。

2.2 miR-200c表達(dá)對(duì)A549/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響

與NC組相比，miR200c mimics組中的A549/DDP細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性顯著增加，IC50值由(37.3±3.1)μmol/L下降至(15.3±3.3)μmol/L(P<0.01)。

2.3 miR-200c對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexinv-FITC/PI 雙染法檢測(cè)miR-200c過(guò)表達(dá)對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過(guò)表達(dá)miR-200c的A549/DDP組的細(xì)胞凋亡率明顯高于NC組(P<0.01；圖2)。

2.4 miR-200c對(duì)A549/DDP細(xì)胞中survivin和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步探討miR-200c逆轉(zhuǎn)A549/DDP耐藥性，我們觀察了miR-200c是否與腫瘤耐藥相關(guān)基因survivin和Bcl-2的蛋白表達(dá)相關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)A549/DDP過(guò)表達(dá)miR-200c后，survivin和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(圖3)。

2.5 miR-200c增加肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性的機(jī)制

通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TUBB3可能是miR-200c的靶基因，而survivin和Bcl-2并非miR-200c的靶蛋白(圖4A)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們首先在A549/DDP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-200c mimics，檢測(cè)TUBB3蛋白和mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-200c后，TUBB3蛋白和mRNA的表達(dá)均下調(diào)(P<0.01；圖4B,C)；其次，我們構(gòu)建了TUBB3 3′UTR野生型和突變型熒光素酶報(bào)告載體，并利用雙熒光素酶活性分析檢測(cè)miR-200c對(duì)TUBB3基因表達(dá)的調(diào)控作用和結(jié)合位點(diǎn)(P<0.01；圖4D)。這些結(jié)果均證實(shí)TUBB3為miR-200c的下游靶基因。最后，為了與miR-200c mimics轉(zhuǎn)染組比較，我們?cè)谶^(guò)表達(dá)miR-200c的A549/DDP細(xì)胞株中同時(shí)轉(zhuǎn)染了pcDNA-TUBB3質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)survivin和Bcl-2蛋白的表達(dá)較miR-200c mimics組上調(diào)(圖4E)。上述結(jié)果證實(shí)miR-200c可通過(guò)下調(diào)其下游靶分子TUBB3的基因表達(dá)下調(diào)survivin和Bcl2蛋白的表達(dá)，最終增加肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。

圖1 A549/DDP細(xì)胞中miR-200c的表達(dá)

圖2 各組細(xì)胞凋亡率結(jié)果

圖3 各組survivin和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況

Figure 3 Expression of survivin and Bcl-2 proteins in each group

圖4 miR-200c通過(guò)調(diào)控其下游靶分子TUBB3而影響survivin和Bcl2的表達(dá)

3 討 論

肺癌的發(fā)病率和死亡率居高不下，是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。多數(shù)肺癌患者，尤其是老年患者，確診時(shí)已屬于中晚期。隨著全球老齡化的加劇，老年肺癌患者的人數(shù)不斷增加。由于老年肺癌患者身體的各個(gè)器官機(jī)能均處于衰退階段，而且患有的基礎(chǔ)疾病較多，故外科治療風(fēng)險(xiǎn)較大；另外，化療雖然是中晚期肺癌治療相對(duì)安全有效的方法，但由于老年患者腎功能減退以及藥物治療不耐受等原因，嚴(yán)重影響了其在老年肺癌患者中的療效[10，11]。

近年來(lái)，由于治療方案的不斷優(yōu)化，靶向藥物不斷涌現(xiàn)，老年肺癌的治療現(xiàn)狀得到了明顯改善[12]。靶向藥物治療和免疫療法在肺癌治療中已取得重大進(jìn)展，而且效果較為顯著，但其高昂的治療費(fèi)用卻使得很多患者望而卻步。目前鉑類化療方案仍然是最常用的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，而且順鉑也是最經(jīng)濟(jì)的治療藥物。順鉑可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡阻止腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制為通過(guò)靶向DNA和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)抑制DNA的轉(zhuǎn)錄與合成[13]。但在肺癌治療的臨床實(shí)踐中，順鉑較高的耐藥率，使其療效明顯降低[14]，這一問(wèn)題亟待解決。

因此，解決腫瘤細(xì)胞的耐藥性、研究逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的機(jī)制與方法對(duì)于提高老年肺癌患者的生存率和改善生活質(zhì)量具有非常重要的意義。

近年來(lái)的大量研究發(fā)現(xiàn)，鉑類藥物在抗腫瘤作用和腫瘤耐藥性中的機(jī)制甚為復(fù)雜。這些機(jī)制通常與胞飲過(guò)程、銅離子受體、谷胱甘肽、銅轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶(ATP7B)以及DNA修復(fù)蛋白等多種因素有關(guān)[4]。因此，目前尚未發(fā)現(xiàn)合適的靶點(diǎn)能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的耐藥性。近來(lái)，miRNA作為調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥及凋亡的關(guān)鍵因子而備受關(guān)注[15,16]。其中miR-200c參與對(duì)多個(gè)經(jīng)典細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲、耐藥及凋亡等過(guò)程。在臨床實(shí)踐中，尤其是老年肺癌患者，通常由于沒(méi)有較好的外科治療條件而不得不將化療作為首選治療方法，但腫瘤細(xì)胞對(duì)化療不敏感，這是所有臨床醫(yī)師面臨的最大挑戰(zhàn)，因?yàn)檫@不僅會(huì)增加患者的痛苦，而且可能會(huì)延誤治療時(shí)機(jī)，降低療效。miR-200c在腫瘤中的異常表達(dá)是抗腫瘤治療療效評(píng)估的一個(gè)重要因素，其作為一種生物標(biāo)志物，使得個(gè)體化診斷及治療成為可能，以此增加抗腫瘤療效，同時(shí)也能緩解惡性腫瘤患者的心理應(yīng)激狀態(tài)[17-19]。survivin僅在腫瘤細(xì)胞和胚胎組織中表達(dá)，其可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡并具有腫瘤特異性，是細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族的成員，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管形成[20]，已成為一個(gè)公認(rèn)的具有較高價(jià)值的腫瘤治療靶點(diǎn)。Bcl-2蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的耐藥性與Bcl-2在腫瘤中的高表達(dá)密切相關(guān)[21, 22]。有研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥的細(xì)胞株A549/DDP中，下調(diào)survivin與Bcl-2蛋白的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。

本研究結(jié)果表明，在非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥的A549/DDP細(xì)胞株中，miR-200c表達(dá)明顯下調(diào)，表明miR-200c的低表達(dá)與腫瘤產(chǎn)生耐藥性的過(guò)程密切相關(guān)。miR-200c mimics轉(zhuǎn)染顯著降低了survivin和Bcl-2蛋白的表達(dá)，同時(shí)可顯著增加A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。這些結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-200c可能通過(guò)對(duì)survivin和Bcl-蛋白表達(dá)水平的調(diào)節(jié)顯著減少細(xì)胞株的順鉑耐藥性。另外，本研究同時(shí)探討了miR-200c對(duì)survivin和Bcl-2蛋白表達(dá)的調(diào)控過(guò)程。TUBB3是唯一一種能夠影響微管穩(wěn)定性的微管蛋白，其表達(dá)的差異直接與化療藥物敏感性相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌腫瘤細(xì)胞中，上調(diào)miR-200c表達(dá)可通過(guò)抑制TUBB3表達(dá)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。本研究同樣發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-200c后，TUBB3蛋白和mRNA的表達(dá)水平均下調(diào)。而且，在過(guò)表達(dá)miR-200c的A549/DDP細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TUBB3基因后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)survivin和Bcl-2蛋白的表達(dá)高于miR-200c mimics組。綜上，我們發(fā)現(xiàn)miR-200c過(guò)表達(dá)可明顯增加順鉑在肺癌治療中的敏感性，能夠?qū)е屡c腫瘤耐藥相關(guān)基因survivin和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平下調(diào)，進(jìn)一步證實(shí) miR-200c可通過(guò)下調(diào)其下游靶分子TUBB3基因的表達(dá)從而下調(diào)survivin和Bcl-2蛋白表達(dá)，以增加肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。

綜上所述，miR-200c通過(guò)對(duì)TUBB3基因表達(dá)調(diào)節(jié)在逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥性的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其作用機(jī)制可能與多種耐藥和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。對(duì)相關(guān)耐藥機(jī)制的進(jìn)一步明確可為老年肺癌患者制定個(gè)體化治療策略提供參考依據(jù)。