張書威，張攻孜，隋熠，李明，呂厚辰，王鐵，張立海

(解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心骨科，北京 100853)

骨質(zhì)疏松癥是常見的骨骼疾病，是一種以骨量低、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞、骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病[1]。骨質(zhì)疏松與增齡相關(guān)，隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)病率增高。骨質(zhì)疏松的最嚴(yán)重后果是骨質(zhì)疏松性骨折[2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，2010年我國(guó)骨質(zhì)疏松性骨折患者達(dá)233萬，相關(guān)醫(yī)療支出649億元[3]。骨質(zhì)疏松已成為我國(guó)面臨的重要公共衛(wèi)生問題。

目前，臨床上普遍采用骨礦密度(bone mineral density，BMD)值診斷骨質(zhì)疏松，并由此預(yù)測(cè)骨折風(fēng)險(xiǎn)。但骨量與骨折風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系并不完善[4]。例如，在相同BMD水平下，75歲女性的髖關(guān)節(jié)和前臂骨折發(fā)病率是是45歲女性的4～7倍[5]，單獨(dú)使用BMD值無法有效預(yù)測(cè)骨折風(fēng)險(xiǎn)。2001年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)將骨質(zhì)疏松定義為以骨強(qiáng)度下降和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的骨骼疾病[6]。骨強(qiáng)度涵蓋骨量和骨質(zhì)量?jī)纱笠亍MD值表示的是單位體積內(nèi)骨骼礦物質(zhì)的密度，即骨量，而除密度外，骨組織的強(qiáng)度還受到其他因素的影響，如羥基磷灰石微晶的礦化、膠原的糖基化以及受離子影響的膠原纖維間犧牲鍵等[7]。本文主要對(duì)可能影響骨質(zhì)量的因素作一探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

納入2016年1月至2016年12月期間在解放軍總醫(yī)院骨科行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的24例股骨頸骨折患者的股骨頭為研究對(duì)象。剔除附著在股骨頭表面的韌帶等軟組織，用浸潤(rùn)磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)的紗布包裹，置于-20℃冰箱，梯度降溫，1℃/min，冷凍封裝保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)基于髖關(guān)節(jié)平片及CT影像示股骨頸骨折，行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)；(2)18～90歲；(3)髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中切除的股骨頭完整，且保存于我院臨床標(biāo)本資源庫；(4)一般情況穩(wěn)定。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)行空心釘內(nèi)固定；(2)孕婦或哺乳期婦女；(3)嚴(yán)重臟器功能衰竭、全身情況不穩(wěn)定、合并風(fēng)濕及強(qiáng)直性脊柱炎等自身免疫病?；颊呋蚣覍倬炇鹬橥鈺?/p>

1.2 方法

篩選所有樣品的骨密度和骨強(qiáng)度，匹配骨密度水平趨近而機(jī)械性能差異顯著的目標(biāo)樣本，研究其骨強(qiáng)度的變化(楊氏模量異質(zhì)性)。

1.2.1 骨密度檢測(cè) 解凍后用生理鹽水洗凈，置入Micro-CT的檢測(cè)掃描管內(nèi)，使用Inveon MM系統(tǒng)對(duì)BMD進(jìn)行分析并記錄，將感性興趣區(qū)域(region of interest，ROI)選擇為主壓力骨小梁區(qū)，沿主壓力方向，取直徑1 cm、高度1 cm的圓柱體檢測(cè)。

1.2.2 骨強(qiáng)度檢測(cè) 在每個(gè)樣本的主壓力骨小梁區(qū)，沿主壓力方向，制作3個(gè)直徑0.7 cm、高度3.0 cm的圓柱體骨柱試件。將骨柱試件置于萬能拉力機(jī)(INSTRON3365)的樣品臺(tái)上，以1 mm/min速度施加壓力，直至試件斷裂。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算機(jī)自動(dòng)輸出載荷-位移曲線，根據(jù)此曲線，可以得到樣品的最大載荷；對(duì)曲線下面積進(jìn)行積分，可得到骨組織斷裂所需要的能量。

1.2.3 楊氏模量異質(zhì)性檢測(cè) 使用Allied低速精密切割機(jī)(TechCut 4)從樣本的相同位置上切取5.0 mm×5.0 mm×5.0 mm立方體，使用30%H2O2溶液脫去油脂及膠原，包埋于聚甲基丙烯酸甲酯中，Yamato真空干燥箱(DP33)中干燥12 h，70℃。用金剛石研磨膏(1.00 μm、0.30 μm、0.05 μm)拋光得到樣品。使用原子力顯微鏡(Bruker，Dimension Icon)掃描樣品，方式：PeakForce QNM；范圍：1 μm×1 μm；頻率：0.5 Hz。掃描后可得到樣品目標(biāo)區(qū)域的高度圖和模量分布圖。使用AFM分析軟件(NanoScope Analysis 1.9)對(duì)樣品進(jìn)行分析，計(jì)算模量分布。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)10次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 骨密度及骨強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果

24例患者的基本資料及骨密度及斷裂功檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

由表1可見，1號(hào)和3號(hào)為目標(biāo)樣品，其BMD值分別為322.29和327.12 mg/cm3，斷裂所需能量分別為(1.05±0.09)J和(0.44±0.04)J，兩個(gè)樣品的BMD值最為接近，且斷裂所需能量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。1號(hào)樣品和3號(hào)樣品的載荷-位移曲線及斷裂所需能量如圖1所示。

2.2 楊氏模量異質(zhì)性檢測(cè)

目標(biāo)樣品的楊氏模量分布圖顯示：1號(hào)樣品模量高低呈散在分布；3號(hào)樣品模量以中央垂直線為軸，軸兩側(cè)模量分布相對(duì)均勻，上方模量較低，下方模量較高(圖2A，B)。1號(hào)和3號(hào)目標(biāo)樣品的楊氏模量值分別為(12.17±0.94)和(13.55±0.72)GPa(圖2C)。

表1 患者骨密度值、等效礦物密度及斷裂功

BMD: bone mineral density.

圖1 載荷-位移曲線

3 討 論

本研究通過對(duì)骨密度數(shù)據(jù)的篩選，匹配骨密度水平趨近而機(jī)械性能差異顯著的一組目標(biāo)樣本，研究骨強(qiáng)度與其納米異質(zhì)性是否有關(guān)。模量分布作為一種定性的檢測(cè)手段，所得的模量分布曲線均值并不能定量地評(píng)價(jià)樣本的模量及硬度，模量的空間分布規(guī)律也值得關(guān)注。本研究結(jié)果表明，1號(hào)和3號(hào)目標(biāo)樣品的楊氏模量值分別為(12.17±0.94)和(13.55±0.72)GPa，數(shù)值接近但模量的空間分布規(guī)律差異很大：1號(hào)樣品模量高低呈散在分布；3號(hào)樣品模量以中央水平線為界面，界面兩側(cè)模量分布相對(duì)均勻。

圖2 楊氏模量檢測(cè)結(jié)果

Tai等[8]就納米級(jí)異質(zhì)性對(duì)骨能量耗散的影響進(jìn)行了四點(diǎn)彎曲的模擬實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，完全均質(zhì)的試件在受到彎曲時(shí)應(yīng)力集中；而模量分布散在的不均勻試件更有利于應(yīng)力的分散，應(yīng)力傳導(dǎo)的距離為均勻試件的近2倍。這似乎可以解釋，平均楊氏模量較高的3號(hào)樣品，因?yàn)榫|(zhì)而更容易造成應(yīng)力集中，而在宏觀機(jī)械性能上表現(xiàn)較差，提示骨強(qiáng)度與其納米異質(zhì)性有關(guān)。骨主要由交聯(lián)的Ⅰ型膠原基質(zhì)和礦化的納米羥基磷灰石晶體組成。過去的研究將骨的彈性性質(zhì)歸因于礦物相，將其可塑性歸因于膠原基質(zhì)。這種簡(jiǎn)單的模型，沒有考慮到兩個(gè)相的相互作用，也沒有考慮每個(gè)相在骨組織的彈性和塑性變形中都起到了作用。像所有復(fù)合材料一樣，骨骼的每種成分對(duì)組織的整體質(zhì)量都有不同、但密切相關(guān)的貢獻(xiàn)。像許多天然材料一樣，骨骼中礦物和有機(jī)質(zhì)的幾何形狀、取向和結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性，可導(dǎo)致其在機(jī)械性能上的異質(zhì)性[9]。由于骨的多層級(jí)性質(zhì)，其機(jī)械性能的異質(zhì)性存在于多個(gè)長(zhǎng)度尺度上。宏觀上，為了適應(yīng)不同的負(fù)載要求，對(duì)于不同的解剖位置，甚至特定解剖位置內(nèi)的不同區(qū)域，機(jī)械性能均存在著明顯的變化[10]。在微觀水平上，納米壓痕進(jìn)一步確定了骨小梁、骨單位與間質(zhì)的模量和硬度差異，這歸因于膠原纖維的取向和各向異性以及礦物質(zhì)含量的變化。在這種長(zhǎng)度尺度上的異質(zhì)性也可能源于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的重塑過程，從而導(dǎo)致“舊”骨和“新”骨的混合[11,12]。經(jīng)歷重塑后，較舊的間質(zhì)骨具有了較高的礦化度，導(dǎo)致剛度增加。

另外，骨作為一種復(fù)合材料，由多種構(gòu)建模塊組成整體，而整體之間存在著界面，對(duì)整體機(jī)械性能而言，界面的重要性與構(gòu)建模塊本身不相上下[13]。過去的研究已經(jīng)注意到了纖維間界面和粘合線[10]：粘合線作為骨單位和基質(zhì)之間的弱界面，在受外力作用時(shí)，能夠?qū)⑽⒘芽p引入其中，即破壞過程發(fā)生在弱界面。本組3號(hào)樣本中模量分布分界的界面可能具有弱界面相似的性質(zhì)，應(yīng)力不僅易于在相對(duì)均質(zhì)的組織中集中，并且容易沿著其界面斷裂。但通過其原子力顯微鏡高度圖，并沒有發(fā)現(xiàn)周期性排布的膠原纖維束和羥基磷灰石片晶，其成因還有待進(jìn)一步研究。